UPLC-MS 法測定烤后煙葉中的5 種游離態(tài)甾醇

郭樂樂，張曉平，劉 芳，席高磊，張明月，武志勇，趙銘欽*

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市金水區(qū)文化路95 號 450002

2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)第三大街8 號 450000

植物甾醇（Phytosterol）是一類天然的植物活性物質(zhì)，廣泛存在于各種植物油、種子和堅果中，也存在于部分蔬菜水果中[1]。植物甾醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)與膽固醇類似，均含有氫化程度不同的1,2-環(huán)戊烷并菲甾核，歸屬于萜類天然產(chǎn)物[2-5]；其C-3位連有羥基，多數(shù)甾醇的C-5 位有雙鍵，C-17 位上連有由8～10 個碳原子構(gòu)成的側(cè)鏈。煙草中的甾醇類主要有豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和膽甾醇[1]，霉變的煙葉中還可能含有麥角甾醇[6]，這幾種甾醇的區(qū)別在于支鏈大小和雙鍵數(shù)目不同，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。甾醇參加光合作用、生殖和免疫過程，某些甾醇還起植物激素的作用[6-7]。植物甾醇經(jīng)生物轉(zhuǎn)化可形成醫(yī)藥中間體雄甾-4-烯-3,17-二酮（4-Androstene-3,17-dione，AD）和雄甾-1,4- 二 烯-3,17- 二 酮（Androst-1,4-diene-3,17-dione，ADD），ADD 是合成甾體藥物的重要原料，且生產(chǎn)工藝路線短、收率高，是我國甾體藥物目前所采用的主要原料薯蕷皂素的優(yōu)良替代品。

研究表明，煙草中甾醇通過高溫裂解后可產(chǎn)生致癌物質(zhì)——稠環(huán)芳烴，以苯并芘最為典型。Lam 等[8]和Badger 等[9]研究表明，豆甾醇在熱解過程中經(jīng)過一系列單分子反應(yīng)可生成菲、蒽等稠環(huán)芳烴。趙偉等[10]研究了豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、膽甾醇以及麥角甾醇的熱裂解及其與主流煙氣中苯并[a]芘（B[a]P）釋放量的關(guān)系，結(jié)果表明，這5 種甾醇熱裂解均易產(chǎn)生稠環(huán)芳烴，卷煙中甾醇的添加量與主流煙氣中B[a]P 釋放量明顯正相關(guān)，其中豆甾醇對B[a]P 釋放量的貢獻最為顯著。

煙草中的甾醇類化合物不僅對煙草感官品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響，也是煙氣中B[a]P 等有害物質(zhì)的重要前體物[11]。對煙草及其制品中的甾醇進行定量分析，對促進卷煙降焦減害研究具有重要意義。傳統(tǒng)測定植物甾醇的方法如重量法、比色法及酶法等，僅能測定甾醇總量，不能實現(xiàn)對某一甾醇的定性和定量分析；近年報道的方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法[12]（HPLC）、氣相色譜法[13]（GC）和氣相色譜-質(zhì)譜法[14]（GC-MS）等。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測靈敏度高、選擇性好，是非揮發(fā)性成分定性、定量測定的有效手段，該技術(shù)也廣泛用于植物甾醇分析[15-21]。在綜合考慮各文獻報道方法和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，本研究中采用UPLC-MS 方法，系統(tǒng)研究了國內(nèi)不同類型、不同品種、不同產(chǎn)地及不同部位烤后煙葉中5 種游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及分布規(guī)律，旨在為卷煙企業(yè)卷煙配方調(diào)控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙葉樣品為河南省駐馬店、三門峽、南陽、平頂山、許昌、洛陽，四川省涼山、攀枝花，貴州省貴陽，云南省昆明，湖南省邵陽，江西省撫州2018 年產(chǎn)的初烤煙葉；四川省德陽和海南省五指山生產(chǎn)的雪茄煙；吉林省吉林生產(chǎn)的曬紅煙、曬黃煙。將煙葉抽去主脈放入烘箱中65 ℃烘烤至質(zhì)量恒定，磨碎成煙末，過560 μm（32 目）篩。

豆 甾 醇（Stigmasterol，≥98%）、β- 谷 甾 醇（β-Sitosterol，≥98%）、菜油甾醇（Campasterol，≥98%）、膽甾醇（Cholesterol，≥96%）、麥角甾醇（Ergosterol，≥95%）（博美生物科技有限公司）；6-酮膽甾烷醇（6-Ketocholestanol，加拿大Toronto Research Chemicals 公司）；甲醇（色譜純，美國Fisher 公司）；水為超純水。

LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Triple TOF 5600+型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；BSA224S 電子天平（感量0.000 1 g，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Thermo Scientific Barnstead Pacific T Ⅱ級純水儀（美國Thermo Scientific 公司）；SB25-12 DTD 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

游離態(tài)甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法參照文獻[22]：采用6-酮膽甾烷醇作為內(nèi)標(biāo)物配制成內(nèi)標(biāo)工作溶液。配制豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、膽甾醇、麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液、一級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理和分析

煙草中游離態(tài)甾醇的分析方法參照文獻[22]：稱取0.2 g 煙末試樣（精確至0.000 1 g）于100 mL 具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入40.0 mL 萃取溶液，振蕩萃取60 min 后，取適量萃取液，過0.22 μm有機濾膜，將濾液轉(zhuǎn)移至色譜瓶中，進行UPLC-MS 分析。分析條件：

色譜柱：Shim-pack XR-ODS Ⅱ毛細(xì)管柱（100 mm×2 mm，2.2 μm）；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL；流動相A：去離子水；流動相B：甲醇。離子源：大氣壓化學(xué)電離源（APCI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；離子對的駐留監(jiān)測時間（dwell time）：96 ms；輔助氣Gas1 壓力：55 Pa；氣簾氣（CUR）壓力：35 Pa；輔助氣Gas2 壓力：55 Pa；碰撞能量（CE）：40 eV；梯度洗脫條件如表1 所示。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions for liquid chromatography

2 結(jié)果與討論

2.1 工作曲線、檢出限

由低濃度到高濃度依次進行UPLC-MS 分析，制作工作曲線得線性回歸方程，所有游離態(tài)甾醇工作曲線的R2均大于0.999，說明工作曲線的線性良好。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液連續(xù)進樣10次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算得檢出限在0.13～1.36 g/mL 之間（表2）。

表2 游離態(tài)甾醇的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限Tab.2 Calibration curves, correlation coefficients,limits of detection of free sterols

2.2 回收率和精密度

稱取1 g 選定的煙葉樣品，分別加入1 mL 高、中、低3 種不同濃度的游離態(tài)甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中，豆甾醇濃度為200、400、600 μg/mL，β-谷甾醇和菜油甾醇濃度均為100、200、400 μg/mL，膽甾醇濃度為10、20、40 μg/mL，麥角甾醇濃度為5、10、20 μg/mL。每個水平重復(fù)5 次，測定回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），表3 中結(jié)果表明，5 種甾醇的加標(biāo)回收率范圍為94.16%～103.18%，RSD 范圍為1.04%～3.75%。說明本方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。

2.3 煙葉中游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

47 個2018 年我國部分煙區(qū)生產(chǎn)的煙葉樣品中游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果的平均值（n=3）見表4。在所研究的煙樣中，游離態(tài)甾醇的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在362.5～1 008.6 μg/g 之間，其中烤煙、雪茄煙、曬煙中游離態(tài)甾醇的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為362.5～806.2、501.5～1 008.6、761.1～992.9 μg/g。豆甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是β-谷甾醇、菜油甾醇、膽甾醇；雪茄煙和曬煙在調(diào)制過程中會產(chǎn)生少量霉變，因此霉變煙葉中還含有少量麥角甾醇。結(jié)果表明，豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、膽甾醇和麥角甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為145.5～457.1、86.8～302.8、101.9～295.8、13.8～72.1 和0～56.2 μg/g。

表3 游離態(tài)甾醇的回收率和精密度Tab.3 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of free sterols

表3（續(xù)）

表4 煙草樣品中5 種游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.4 Contents of five free sterols in tobacco samples （μg·g-1）

表4（續(xù)） （μg·g-1）

2.3.1 不同類型煙葉游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

烤煙、雪茄煙和曬煙3 種類型煙葉游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的結(jié)果見圖2。可知，烤煙及曬煙各游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)從大到小依次為豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、膽甾醇。雪茄煙各游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)從大到小依次為豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、膽甾醇。可見，不同類型煙葉中豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、膽甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異。

2.3.2 不同品種煙葉游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)河南地區(qū)的貴煙2 號、豫煙6 號、云煙87、秦?zé)?6、遼煙20、NC71 六個烤煙品種中部煙葉游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的結(jié)果見圖3。可知，不同品種煙葉游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定差異。貴煙2 號、云煙87、NC71 品種烤煙游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化順序是豆甾醇＞菜油甾醇＞β-谷甾醇＞膽甾醇，其余品種煙葉游離態(tài)甾醇變化順序是豆甾醇＞β-谷甾醇＞菜油甾醇＞膽甾醇。說明煙葉品種不同，游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異。

圖2 不同類型煙葉樣品中游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.2 Contents of free sterols in different type tobacco samples

圖3 不同品種煙葉中游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Contents of free sterols in tobacco leaves of different varieties

2.3.3 不同產(chǎn)地?zé)熑~中游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

四川涼山、攀枝花，以及河南駐馬店、貴州貴陽、江西撫州、湖南邵陽6 個產(chǎn)地的云煙87 中部煙葉的游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的結(jié)果見圖4。可知，各產(chǎn)地游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異，即駐馬店、貴陽、撫州3 個產(chǎn)地?zé)熑~中菜油甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于β-谷甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，攀枝花產(chǎn)地?zé)熑~中β-谷甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于豆甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。6 個產(chǎn)地?zé)熑~品種相同。可見產(chǎn)地對煙葉5 種游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有影響。

圖4 不同產(chǎn)地?zé)熑~中游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.4 Contents of free sterols in tobacco leaves from different planting areas

2.3.4 不同部位煙葉游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

烤煙、雪茄煙和曬煙的上部煙、中部煙和下部煙樣品游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的結(jié)果分別見圖5、圖6 和圖7。可知，不同部位煙葉游離態(tài)甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異，烤煙和曬煙3 個部位煙葉游離態(tài)甾醇的分布是豆甾醇＞β-谷甾醇＞菜油甾醇＞膽甾醇；而雪茄煙上部和中部煙葉游離態(tài)甾醇的分布是豆甾醇＞菜油甾醇＞β-谷甾醇＞膽甾醇，雪茄煙下部煙葉游離態(tài)甾醇的分布是豆甾醇＞β-谷甾醇＞菜油甾醇＞膽甾醇。

圖5 烤煙上部、中部和下部煙葉游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.5 Contents of free sterols in upper, middle and bottom leaves of flue-cured tobacco

圖6 雪茄煙上部、中部和下部煙葉游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.6 Contents of free sterols in upper, middle and bottom leaves of cigar tobacco

圖7 曬煙上部、中部和下部煙葉游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.7 Contents of free sterols in upper, middle and bottom leaves of sun-cured tobacco

3 結(jié)論

①不同類型、不同品種、不同產(chǎn)地、不同部位的2018 年我國部分煙區(qū)生產(chǎn)的煙草樣品中游離態(tài)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布情況呈現(xiàn)一定的趨勢：豆甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是β-谷甾醇、菜油甾醇、膽甾醇和麥角甾醇；②烤煙、曬煙的β-谷甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于菜油甾醇，而雪茄煙中菜油甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于β-谷甾醇；不同品種、部位和產(chǎn)地的煙葉中豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、膽甾醇、麥角甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，烤煙、雪茄煙、曬煙游離態(tài)甾醇的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)也存在差異。