不同烤煙品種煙葉衰老特性與內源激素的關系

魏 星，武云杰，闞洪贏，蔡文龍，張小全

河南農業大學煙草學院，鄭州市農業路63 號 450002

烤煙是以收獲葉片為目的的經濟作物，煙葉成熟的過程即是逐漸衰老的過程，此階段也是煙葉品質形成最關鍵的時期[1-2]。植物衰老是由基因調控并受內外因素的影響，最終導致整株植物的死亡[3]。其中，植物激素對于葉片的生長發育進程有重要的調控作用[4]，這些激素一般分為延遲衰老和促進衰老兩大類，共同調節植物的衰老[5-6]。有研究發現，當外部環境發生變化時，環境壓力會間接促進加速衰老的激素含量升高，同時促進生長類的激素含量下降，主要過程是植物激素影響感知信號ETR1、TIR1 等，通過傳導信號EIN、MYC、bHLH3 等傳遞至衰老受體SAGs 和SEN 等衰老相關基因[7-10]。逆境脅迫研究發現，長日照可促進GA 合成，有利于植物生長；短日照則促進ABA 合成，加速植物體衰老。低溫和高溫、水分脅迫、無機營養不足等逆境均可加速植物葉片的衰老[11]。目前，已從水稻、擬南芥等模式植物中克隆出了多個與衰老相關的基因，根據這些基因在葉片衰老期表達量的變化，分為衰老下調基因（SDGs）和衰老上調基因，也稱為衰老相關基因（SAGs）[12]。在植物體衰老期間，參與植物光合作用、生物合成相關的基因表達量下調；葉片衰老過程中大分子化合物被降解轉移，大量編碼蛋白酶及參與營養物質分解代謝及轉運蛋白的基因會在葉片衰老過程中表達上調[13-14]。還有一些高度衰老特異表達基因，只在葉片衰老程度較高時才被檢測出上調表達，如LSC54、SAG12 和SAG13[15]等。但目前激素與衰老的關系研究多集中在逆境脅迫條件下，而對于煙葉衰老方面的研究多集中在施氮量對質體色素含量、氮代謝、成熟采收等方面的影響[16-17]，有關烤煙內源激素調控的相關基因與衰老相關基因的關系方面則鮮見報道，同時品種間衰老特性的差異研究也較少。為此，選取田間成熟落黃表現不同的4 個烤煙品種豫煙10 號、云煙87、K326 和NC89，在相同栽培管理條件下，對不同葉齡中部葉的葉綠素含量、衰老標志基因、內源激素含量及相關基因表達量的變化進行了分析，旨在明確不同烤煙品種煙葉衰老特性與內源激素變化的關系，為進一步調控煙葉衰老進程、選育適宜衰老特性的品種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018 年在河南農業大學許昌校區進行。供試材料為多年種植觀察田間成熟落黃表現不同的4 個烤煙品種豫煙10 號、云煙87、K326 和NC89。土壤類型為輕壤土，有機質10.77 g/kg、全氮0.96 g/kg、堿解氮48.7 mg/kg，速效磷51.8 mg/kg，速效鉀103.7 mg/kg，pH 7.56。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機區組設計，3 次重復，每小區面積120 m2，行株距為120 cm×50 cm。3 月1 日播 種，5 月5 日 移 栽，施純 氮45 kg/hm2，N ∶P2O5∶K2O=1∶2:3。肥料為煙草復合肥（10-12-18）、重過磷酸鈣和硫酸鉀。5 月5 日施入基肥，6 月5 日追肥，基追肥比例為7∶3，打頂后單株留葉20 片。其他田間管理按照當地優質煙生產技術規范進行。

選取整齊一致的煙株，以中部葉第10～12 片葉（自下向上數）為研究對象，以葉長1.5 cm 時掛牌計算葉齡，分別于葉齡30、40、50、60 和70 d 時取樣。每個品種每次從5 株煙上分別取5 片葉，取中部葉片，以主脈為界分成兩部分，充分剪片混勻分兩份保存，一部分用于測定內源激素和葉綠素含量（質量分數）；另一部分用液氮迅速冷卻帶回實驗室，并于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于衰老標志基因和激素相關基因表達量的測定。

1.3 測定項目及方法

采用分光光度法測定葉綠素含量[18]。采用酶聯免 疫 吸 附 法[19]測 定 脫 落 酸（ABA）、生 長 素（IAA）、細胞分裂素（CTK）和赤霉素（GA）含量。

按照TRIZOL（Invitrogen 公司）試劑說明書中的步驟進行樣品總RNA的提取，反轉錄模版用量為2 μ g，參 照 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛Fermentas 公司）產品說明書進行反轉錄，合成第一鏈cDNA。采用PCR 儀（iQ5，美國Bio-Rad 公司）進行PCR 擴增。反應結束后分析熒光值的變化。將CT值導入Excel 2007，按照公式2-△△CT計算目的基因的相對表達量[20]，并繪制相關圖形。以煙草L25基因為內參基因，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.4 數據處理

采用DPS 2007 和Excel 2010 軟件進行試驗數據的處理與分析以及圖形的繪制，用Duncan’s 法進行數據間差異的顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同烤煙品種葉片發育過程中葉綠素含量的變化

從葉齡30 d 開始，4 個烤煙品種的葉綠素含量均開始下降，品種間變化規律一致，見圖1。葉綠素含量在葉齡60 d 時品種間差異不顯著，但在葉齡60～70 d 時，豫煙10 號品種葉綠素降解量增大，降解量達到0.46±0.02 mg/g，在葉齡70 d 時的葉綠素含量顯著低于其他品種。NC89 品種在該時期葉綠素含量較其他品種仍然保持較高水平。

圖1 不同烤煙品種葉片發育過程中葉綠素含量的變化Fig.1 Variations of chlorophyll content during leaf development of different flue-cured tobacco varieties

2.2 不同烤煙品種葉片發育過程中衰老標志基因表達量比較

圖2 不同烤煙品種葉片發育過程中衰老標志基因相對表達量的變化Fig.2 Variations of senescence marker genes during leaf development of different flue-cured tobacco varieties

CP1 在葉齡50 d 時，云煙87、K326 和豫煙10號品種的表達量顯著升高，其中豫煙10 號較上一時期變化量最大，是上一時期的3.05 倍（圖2A）。品種間差異顯著，表達量最高的豫煙10 號與其他3 個烤煙品種間存在極顯著差異。在葉齡60 d時，4 個品種的表達量均表現出上升趨勢，說明此時期各品種均有明顯的衰老變化。其中豫煙10號表達量最高，達到了27.756，且與其他3 個烤煙品種間存在極顯著差異。云煙87 較上一時期也出現明顯增幅。而NC89 和K326 增幅相對較小，兩個品種間無差異。在葉齡70 d 時，各品種的表達量持續增高。而NC89 的表達量依然相對同時期其他品種較低且與其他3 個品種間差異極顯著，這一品種間差異和變化趨勢與CP1 趨勢一致（圖2B）。

4 個烤煙品種的PSA1 基因表達量表現出逐漸下降的趨勢，品種間變化規律一致（圖2C）。在葉齡30 d 時，NC89 和K326 品種的表達量相對較高，但兩個品種間無差異；而云煙87 和豫煙10 號的表達量較低，品種間無差異；但表達量較高的兩個品種與表達量較低的兩個品種之間均存在顯著差異。從葉齡40～60 d，PSA1 基因表達量持續降低，品種間差異不顯著。而在葉齡70 d 時，表達量達到了最低值，其中豫煙10 號品種表達量最低，NC89 品種表達量相對較高，兩個品種間表現出極顯著差異。MC 基因表達模式與PSA1 相似（圖2D）。說明在不同烤煙品種的衰老過程中，NC89品種在生長發育的后期較其他3 個品種生長旺盛，而豫煙10 號則衰老程度較高。

2.3 不同烤煙品種葉片發育過程中內源激素含量比較

圖3A 顯示，在煙草衰老葉片中IAA 含量逐漸降低，4 個烤煙品種的下降速率出現差異，豫煙10號品種在葉齡60 d 時，IAA 急劇下降，當葉齡70 d時其含量下降到最低水平；從葉齡60～70 d 時，K326 品種的IAA 含量降幅最大，云煙87 降幅次之，而NC89 在葉齡50～70 d 之間，降幅變化最小，尤其是葉齡60 和70 d 時，NC89 的IAA 含量在4 個烤煙品種中含量最高，且與其他品種間差異達到極顯著水平。

GA3和CTK 在衰老過程中整體上也呈下降趨勢，NC89 品種在衰老進程中含量始終保持較高水平，說明NC89 在4 個烤煙品種中衰老變化不明顯（圖3B、圖3C）。ABA 含量（圖3D）在衰老過程中出現先上升后下降而后上升的變化趨勢，品種間變化規律一致。在葉齡50～60 d 時，4 個烤煙品種的ABA 含量均開始上升，豫煙10 號升高幅度最大，NC89 升幅最小，而與ABA 有拮抗作用的GA3表現出相反的變化規律，這說明ABA 和GA3共同調節煙葉的衰老進程，但作用相反。

2.4 不同烤煙品種葉片發育過程中內源激素代謝相關基因表達量變化

圖3 不同烤煙品種葉片發育過程中內源激素含量的變化Fig.3 Variations of endogenous hormone contents during leaf development of different flue-cured tobacco varieties

NtEFE26 是乙烯合成依賴基因，在煙葉衰老過程中4 個烤煙品種NtEFE26 基因的表達量均呈先上升后下降而后上升的趨勢，品種間變化規律一致（圖4A）。在葉齡40 d 時，NtEFE26 基因表達量出現升高，說明在此時期煙葉乙烯合成旺盛。當葉齡在50～70 d 之間時NtEFE26 基因表達量持續升高，在葉齡70 d 時表達量達到最大值。環氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）是高等植物ABA 生物合成的關鍵調控酶，在衰老過程中4 個烤煙品種的NtNCED1 基因表達量（圖4B）變化規律與ABA相似。在葉齡40 d 時出現了較大幅度的上調表達，這可能是由于在此時期，田間出現的干旱情況，導致該基因表達量升高，進而ABA 的含量有所升高，來應對出現的短暫干旱脅迫。在衰老后期，葉齡60～70 d 時NC89 的表達量增幅緩慢，因此導致其ABA 含量上升緩慢，其衰老程度較低。NtPR1b 基因相對表達量（圖4C）隨著煙葉衰老其表達量逐漸升高，而NtCHN50 基因表達量（圖4D）則逐漸降低，說明隨著葉片衰老進程的加劇，對衰老有促進作用的JA 含量逐漸升高，而延緩葉片衰老的SA 含量則逐漸降低。在葉齡50 d 后，豫煙10號的NtPR1b 表達量在4 個烤煙品種中為最高，最早表現出衰老癥狀，而NC89 則衰老表現相對緩慢。

圖4 不同烤煙品種葉片發育過程中內源激素代謝相關基因相對表達量的變化Fig.4 Variations of relative expressions of genes related to endogenous hormone metabolism during leaf development of different flue-cured tobacco varieties

3 討論

葉綠素含量下降是煙草葉片衰老的標志，其衰老程度越高，降解量越大，并受激素含量的影響[21-22]。在葉齡50 d 后，除NC89 品種外的其他3個品種葉綠素降解量均開始增加，這與高度衰老特異表達基因CP1 和CP23 的高表達研究結果一致[23-24]。因此，衰老速度快的品種豫煙10 號激素含量響應最早，葉綠素降解量最大，與其衰老基因啟動較早有關。

激素含量的動態變化分析表明，煙葉成熟后期對衰老起促進作用的激素在豫煙10 號中含量顯著高于NC89。ABA 是一種逆境響應調節激素[25]，在前期略有干旱時表現為上升，恢復正常生長后下降到正常水平，之后隨著衰老而再次上升，并與GA3表現出相反的變化規律。一方面說明一定條件下不同品種對逆境反映出的規律具有一致性，但品種間存在差異；另一方面說明前期的輕微干旱在灌水后煙株通過自我調節能恢復正常生長狀態，GA3保持較高水平時煙葉不會過早進入快速衰老狀態[5]。因此，ABA 和GA3共同調節煙葉的衰老進程，且有明顯的拮抗作用，這與ABA 生物合成的關鍵調控基因NtNCED1 表達量大幅升高相一致[26]。衰老達到一定程度后產生乙烯，在植物成熟衰老過程中具有特殊的作用[27]，豫煙10 號在此階段的NtEFE26 基因表達量一直保持較高水平，說明其衰老程度較高，這與蔣博文等[28]的研究結果一致。本研究中發現，茉莉酸響應基因NtPR1b[29-31]與生長素含量、水楊酸應答基因NtCHN50[32]的變化趨勢相反，說明生長素、水楊酸與茉莉酸在誘導葉片衰老中表現出相反的功能[33-34]，在調控煙葉衰老中有明顯的拮抗作用[35-36]，其調控機制還有待進一步研究。

因此，衰老上調標志基因的表達與促進衰老的激素含量動態變化一致，衰老下調基因與延遲衰老的激素含量動態變化一致，這一關系與激素的代謝調控有關。可能是激素代謝基因控制的內源激素含量的改變，通過感知信號和傳導信號作用于衰老基因的結果[37-38]，尚需要進一步深入研究。

4 結論

不同烤煙品種成熟衰老特性存在差異，品種間差異與內源激素的代謝有關。成熟落黃快的品種在衰老后期衰老上調標志基因CP1 和CP23 的表達量較高，具有ABA、乙烯、茉莉酸代謝旺盛的特點；成熟落黃慢的品種則與其相反，具有衰老下調表達基因PSA1、MC 的表達量高，GA3、CTK、IAA和水楊酸代謝旺盛的特點。因此，可依據不同烤煙品種煙葉衰老特性與內源激素含量變化的特點，有效調控煙葉衰老進程和選育具有適宜衰老特性的品種。