流式細(xì)胞儀檢測微細(xì)膠黏物中尼羅紅染料選擇性吸附的研究

張新莉 楊曉莉 潘玙璠 卞能源 卜 鑫侯慶喜 裴繼誠，* 張方東，*

（1.天津科技大學(xué)天津市制漿造紙重點實驗室，天津，300457；2.新疆哈密市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，新疆哈密，839000）

膠黏物給廢紙回用帶來很大危害，因此廢紙漿中膠黏物的去除已成為研究重點。不同手段有不同的去除效果，關(guān)鍵是尋找一種快捷而高效的檢測方法。但由于膠黏物來源廣泛，成分復(fù)雜，其分類不同，檢測方法也不同。按照膠黏物的粒子尺寸大小，一般可將其分為大膠黏物、微細(xì)膠黏物、溶解和膠體類物質(zhì)[1]，如表1 所示。其中大膠黏物的分析檢測普遍使用TAPPI T 277 標(biāo)準(zhǔn)[2]和INGEDE 法[3]，這些方法是通過篩選操作結(jié)合圖像分析來對大膠黏物進(jìn)行分析檢測，能夠通過篩板篩選的是微細(xì)膠黏物。目前采用的分析檢測手段多種多樣，如濁度法[4]、有機溶劑抽提法[5]、冷藏過濾法[6]等。但由于這些檢測方法普遍耗時較長、操作量大，容易產(chǎn)生檢測誤差，不適于實際生產(chǎn)使用，因此具有一定的局限性和不準(zhǔn)確性。

表1 膠黏物分類

2002 年，BASF 公司提出熒光計數(shù)法，結(jié)合流式細(xì)胞儀對微細(xì)膠黏物進(jìn)行分析檢測[7]。相比于傳統(tǒng)的檢測方法，流式細(xì)胞儀具有快速、直觀和操作簡便等優(yōu)勢，能夠更加直接地觀察到漿料中微細(xì)膠黏物的數(shù)量、顆粒大小變化及膠黏物控制效果[8-10]。流式細(xì)胞儀以激光為光源照射樣品流，使熒光染色的顆粒激發(fā)熒光并產(chǎn)生標(biāo)記和計數(shù)，檢測中熒光探針的使用直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測微細(xì)膠黏物常用尼羅紅（Nile Red）作為熒光探針，尼羅紅（9-（二乙胺基）-5-氫-苯并[a]吩惡嗪-5-酮）是一種獨特的中性疏水探針，在疏水環(huán)境中可以發(fā)出強熒光[11-12]，其激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為570 nm[13]，常作為熒光染料用于脂類和蛋白質(zhì)等的染色。膠黏物由于含有脂類物質(zhì)如甘油三酸酯（TG）、聚丙烯酸酯（PA）等，可被Nile Red 吸附，但白水中除了微細(xì)膠黏物還存在細(xì)小纖維和無機填料等物質(zhì)，因此Nile Red 對微細(xì)膠黏物的選擇性吸附對于流式細(xì)胞儀檢測微細(xì)膠黏物尤為重要。本研究著重探究Nile Red 染料對白水中微細(xì)膠黏物及其他細(xì)小組分的吸附情況，驗證流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而為流式細(xì)胞儀更快速、便捷的應(yīng)用于造紙領(lǐng)域提供借鑒。

1 實 驗

1.1 材料及試劑

漂白硫酸鹽針葉木漿（NBKP）漿板為智利銀星牌商品漿；國產(chǎn)舊瓦楞箱紙板（OCC）和舊報紙（ONP）；Nile Red染料，德國Sysmex Partec Gmbh；纖維素酶，酶活700 EGU/g，諾維信公司（Novozymes A/S）；冰醋酸，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；三水合乙酸鈉，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

1.2 實驗儀器與設(shè)備

流式細(xì)胞儀：CyFlow?Cube 6，德國Sysmex Partec Gmbh；DDJ 動態(tài)濾水儀：MT2110-086CF，美國；快速水分測定儀：HB43-S，瑞士METTLER TOLEDO；標(biāo)準(zhǔn)疏解機：970154，瑞典L&W公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 白水樣品的制備

將漂白硫酸鹽針葉木漿板撕成小塊，浸泡后用Valley 打漿機疏解20 min，調(diào)節(jié)漿濃至1%，充分打散后再經(jīng)動態(tài)濾水儀過濾（100 目濾網(wǎng)），濾液為含有細(xì)小纖維和少量殘余抽出物的白水。將廢紙漿（ONP 漿和OCC 漿）浸泡過夜后用疏解機疏解10 min，調(diào)節(jié)漿濃為1%，再經(jīng)動態(tài)濾水儀過濾（100目），濾液即為含有細(xì)小纖維、少量殘余抽出物及其他人工合成類膠黏物的白水樣品。

1.3.2 白水樣品的染色

取100 μL 白水，滴加Nile Red 染料10 μL，充分混合后置于常溫暗處靜置5 min染色。

1.3.3 苯-醇抽提處理

準(zhǔn)確稱取2 g 漂白硫酸鹽針葉木漿板，用預(yù)先通過苯-醇混合液抽提過的濾紙和棉線包扎好，置于索氏抽提器中，加入約150 mL 的苯-醇混合液（超過抽提器的溢流水平），裝上冷凝器后置于水浴鍋中，從第1滴混合液滴下時開始計時，抽提時間為6 h。

1.3.4 白水中細(xì)小纖維的降解

取100 mL白水，用乙酸-乙酸鈉緩沖溶液將樣品pH值調(diào)節(jié)為4.8，然后添加纖維素酶，纖維素酶的最佳用量為15 EGU/100 mL白水。將加入纖維素酶的白水樣品置于溫度為50℃的恒溫?fù)u床中，在轉(zhuǎn)速150 r/min條件下處理24 h[14]。

1.3.5 膠黏物檢測標(biāo)準(zhǔn)門的劃分

膠黏物檢測標(biāo)準(zhǔn)門的劃分用來區(qū)分Nile Red 染料吸附的顆粒和Nile Red 染料未吸附的顆粒。通過對比OCC、ONP 兩種常見廢紙漿在Nile Red 染料染色前后的檢測結(jié)果，圈劃出膠黏物區(qū)域，排除系統(tǒng)誤差及背景的影響，將其疊加后得到如圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)門。該標(biāo)準(zhǔn)門在圖1 中各個點的坐標(biāo)分別為（111，330）（4295， 261）（17791， 743）（12415， 14996）（5330，26192）（828，18777）（200，13706）（93，7237）（69，2944）（82，500）。

圖1 膠黏物檢測標(biāo)準(zhǔn)門

圖2 FSC光強-粒徑標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.6 顆粒粒徑標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

流式細(xì)胞儀中前向角散射（FSC）的光強與顆粒尺寸正相關(guān)，取已知粒徑2.0、5.11、7.61、10.1、16.2 μm 標(biāo)準(zhǔn)微球，通過流式細(xì)胞儀檢測，得到不同粒徑微球?qū)?yīng)的FSC 光強，繪制如圖2 所示的FSC 光強與粒徑的標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。由圖2 可以看出，F(xiàn)SC 光強與顆粒粒徑呈線性相關(guān)，兩者的線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9922，擬合度較好。

2 結(jié)果與討論

2.1 Nile Red染料對廢紙漿的染色效果

為了驗證Nile Red染料對廢紙漿白水中疏水性物質(zhì)的吸附情況，用Nile Red染料對ONP、OCC廢紙漿白水染色，通過流式細(xì)胞儀檢測得到其顆粒濃度和FSC光強，并計算顆粒的平均粒徑，結(jié)果如表2所示。兩種廢紙漿染色前后FSC-FL3圖分別如圖3和4所示，其中FSC為前向角散射，F(xiàn)L3為第三熒光通道。由表2可知，兩種廢紙漿白水中顆粒濃度分別為1487個/μL和1838個/μL，F(xiàn)SC光強分別為760和819，白水中顆粒平均粒徑分別為3.20 μm和3.28 μm。從圖3和圖4可以看出，在加入Nile Red染料染色后，大部分疏水性顆粒具有了熒光性，出現(xiàn)在劃定的膠黏物門中，說明Nile Red染料可對ONP和OCC兩種廢紙漿中疏水性顆粒選擇性吸附。

2.2 漿料用水對Nile Red染料染色的影響

由于白水中成分復(fù)雜，膠黏物標(biāo)準(zhǔn)門中檢測到的顆粒無法確定全部為微細(xì)膠黏物顆粒。為了進(jìn)一步分析廢紙漿中所檢測到的顆粒是否全部為微細(xì)膠黏物的顆粒，首先通過Nile Red 染料對實驗過程中用到的自來水（模擬造紙用水）和超純水進(jìn)行染色，檢測結(jié)果見表3。由表3 可知，自來水可能由于管道運輸?shù)仍颍渲写嬖谝恍┦杷灶w粒可被Nile Red 染料吸附并被流式細(xì)胞儀檢測到，其顆粒濃度達(dá)到62 個/μL，平均粒徑為3.15 μm，對實驗結(jié)果有一定影響。超純水中幾乎不含有能被Nile Red 染料吸附的顆粒物質(zhì)，其顆粒濃度幾乎為0。因此可以排除檢測過程中超純水對實驗結(jié)果的影響。在接下來對漂白硫酸鹽針葉木漿白水染色的實驗中所有用水均使用超純水，排除自來水對結(jié)果的影響。而在實際應(yīng)用時可提前對工廠實際用水進(jìn)行檢測排除，減少流式細(xì)胞儀檢測誤差。

表2 ONP白水和OCC白水中顆粒濃度、FSC光強和平均粒徑

圖3 Nile Red染料染色前后ONP漿白水FSC-FL3圖

圖4 Nile Red染色前后OCC漿白水FSC-FL3圖

表3 自來水和超純水中顆粒濃度、FSC光強和平均粒徑

2.3 白水中其他細(xì)小組分對Nile Red染料染色的影響

2.3.1 抽出物對Nile Red染色的影響

使用超純水排除了漿料用水對Nile Red染料的影響后，再對白水中其他組分進(jìn)行檢測。膠黏物一般分為天然樹脂和人工合成物兩大類。天然樹脂一般指木材抽出物，主要來源自原生纖維，主要包括樹脂酸、脂肪酸、甘油三酸酯、樹脂、蠟、脂肪、甾醇酯等物質(zhì)。利用苯-醇抽提排除漂白漿中的抽出物，再經(jīng)Nile Red染料對苯-醇抽提前后的漿料白水進(jìn)行染色檢測，結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，未經(jīng)苯-醇抽提的白水顆粒濃度為246個/μL，平均顆粒粒徑為3.28 μm，經(jīng)過苯-醇抽提后白水顆粒濃度為269個/μL，平均顆粒粒徑為3.24 μm。經(jīng)過苯-醇抽提的和未經(jīng)苯-醇抽提的漂白硫酸鹽針葉木漿的白水，其顆粒濃度和平均顆粒粒徑均沒有明顯變化。原因可能是漂白漿中的抽出物仍有部分殘余會影響結(jié)果，但總體來說抽出物的影響不大，白水中仍存在一些疏水性物質(zhì)可被染料選擇性吸附，對檢測結(jié)果造成影響。

表4 苯-醇抽提前后的白水顆粒濃度、FSC光強和平均粒徑

2.3.2 細(xì)小纖維對Nile Red染色的影響

白水中由于細(xì)小纖維的存在，可能會被Nile Red 染料吸附，因此通過纖維素酶將白水中的細(xì)小纖維降解為單糖或低聚糖，以除去細(xì)小纖維的影響，隨后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，纖維素酶處理前后的白水顆粒濃度、FSC 光強和平均粒徑對比見表5。由表5 可以看出，經(jīng)過纖維素酶處理后的漂白硫酸鹽針葉木漿白水中可以被Nile Red 染料吸附的顆粒明顯減少，從246 個/μL 減少到61 個/μL，其顆粒平均粒徑也從3.19 μm 減少到2.98 μm。圖5 為纖維素酶處理前后漂白硫酸鹽針葉木漿白水FSC-FL3 圖。從圖5 可以看到，纖維素酶處理前檢測門中有明顯的被染色的顆粒，纖維素酶處理之后大部分消失。說明細(xì)小纖維的存在影響檢測結(jié)果，細(xì)小纖維降解后可被染料吸附的顆粒減少，其平均粒徑也有所下降。因此白水中細(xì)小纖維可以被Nile Red 染料吸附，從而激發(fā)熒光被流式細(xì)胞儀檢測到，對最后檢測結(jié)果造成影響。

圖5 加入Nile Red染料的纖維素酶處理前后漂白硫酸鹽針葉木漿白水FSC-FL3圖

表5 纖維素酶處理前后的白水顆粒濃度、FSC光強和平均粒徑對比

2.4 廢紙漿微細(xì)膠黏物檢測校正系數(shù)

細(xì)小纖維的存在會對檢測結(jié)果造成影響，因此在實際應(yīng)用時可提前確定校正系數(shù)。通過纖維素酶對ONP 和OCC 兩種廢紙漿白水中的細(xì)小纖維降解，得到如表6所示的校正系數(shù)。

校正系數(shù)計算如式（1）所示。

式中，n 為廢紙漿檢測校正系數(shù)，%；m 為酶處理后檢測廢紙漿白水的顆粒濃度，個/μL；m0為酶處理前檢測廢紙漿白水的顆粒濃度，個/μL。

表6 中數(shù)據(jù)表明，通過纖維素酶降解廢紙漿白水中細(xì)小纖維后，其顆粒濃度有所下降，OCC漿的顆粒濃度減少到1624 個/μL，為纖維素酶處理前的83.25%，ONP 漿的顆粒濃度減少到1352個/μL，為纖維素酶處理前的86.84%。因此初步確定實驗室檢測廢紙漿結(jié)果校正系數(shù)為85%。FSC 光強變化不大，因此其顆粒平均粒徑也幾乎沒有變化。

表6 廢紙漿微細(xì)膠黏物檢測校正系數(shù)

3 結(jié) 論

本研究采用尼羅紅（Nile Red）染料分別對舊報紙（ONP）漿和舊瓦楞箱紙板（OCC）漿白水、苯-醇抽提前后漂白硫酸鹽針葉木漿白水、纖維素酶處理前后漂白硫酸鹽白水進(jìn)行染色，隨后用流式細(xì)胞儀檢測分析。

3.1 ONP 漿白水中顆粒濃度為1487 個/μL，顆粒平均粒徑為3.20 μm；OCC 漿白水中顆粒濃度為1838個/μL，顆粒平均粒徑為3.28 μm。表明染料對白水中顆粒選擇性吸附，增強了廢紙漿白水中疏水性顆粒的熒光性使得原先熒光性光微弱或者不顯示熒光性的疏水性顆粒顯示出熒光特性。

3.2 自來水中檢測到顆粒濃度為62 個/μL，顆粒平均粒徑為3.15 μm。表明自來水中存在能夠被Nile Red 染料吸附的顆粒，廢紙漿中被檢測到的顆粒不全是微細(xì)膠黏物。而超純水中幾乎不含能夠吸附Nile Red染料的顆粒，對最終檢測結(jié)果幾乎沒有影響。

3.3 苯-醇抽提前漂白硫酸鹽針葉木漿的白水中顆粒濃度為246 個/μL，顆粒平均粒徑為3.28 μm；苯-醇抽提后漂白硫酸鹽針葉木漿白水中顆粒濃度為269個/μL，顆粒平均粒徑為3.24 μm，沒有明顯變化，表明苯-醇抽出物對檢測結(jié)果無明顯影響，漂白硫酸鹽針葉木漿白水中仍存在可被Nile Red 染料吸附的物質(zhì)；用纖維素酶降解漂白硫酸鹽針葉木漿白水中細(xì)小纖維后，白水中可被檢測的顆粒濃度從246 個/μL 減少到61 個/μL，顆粒平均粒徑從3.19 μm 減少為2.98 μm，表明細(xì)小纖維的存在會被染料吸附并影響檢測結(jié)果。

3.4 確定實驗室流式細(xì)胞儀檢測廢紙漿顆粒濃度的結(jié)果校正系數(shù)為85%。