酚化改性木質素與纖維素酶相互作用研究

牟洪燕 黃 瑾 李維英 樊慧明 詹懷宇

（1.華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東廣州，510640；2.華南理工大學輕工與食品實驗教學示范中心，廣東廣州，510640；3.新益昌自動化設備有限公司，廣東深圳，518103）

木質素對纖維素酶的吸附主要是通過疏水作用、靜電作用和氫鍵作用來實現(xiàn)的。木質素對纖維素酶的吸附親和力與木質素的化學結構密切相關，如酚羥基、羧酸基等官能團[1]。酚羥基含量與木質素對纖維素酶的吸附能力成正比[2]。改變pH值會顯著改變纖維素酶的表面電荷，使木質素與纖維素酶的吸附親和力發(fā)生變化[3]。有研究者提出通過pH誘導木質素表面修飾，以減少其與非特異性纖維素酶的結合，從而促進木質纖維素的酶水解[4]。基于木質素的化學性質和其對纖維素酶的吸附能力，木質素-纖維素酶復合物具有固定纖維素酶的潛在功能[5-6]。姚蘭等人[7]對比研究了不同木質素對纖維素酶的吸附作用。劉祖廣等人[8]通過苯酚改性硫酸鹽木質素得到酚化木質素，并對比研究了改性前后木質素的性能差異。由于酚化木質素含有更多的酚羥基和游離反應位點[9],因此采取酚化改性來提高木質素的反應活性。本研究以間苯二酚和連苯三酚為酚化試劑，分別對桉堿木質素進行了酚化改性以增加酚羥基的含量，比較了不同側鏈結構的酚化木質素對纖維素酶吸附的影響。綜合分析比較了不同酚化木質素對纖維素酶吸附作用的差異，并對酚化木質素的物化性質進行了表征。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

桉木片取自博匯制漿廠；間苯二酚、連苯三酚、氫氧化鈉、硫酸、乙酸、乙酸鈉、丙酮等試劑均取自Sigma-Aldrich公司；賽力二代纖維素酶（Cellic CTec2）取自Novozymes公司。以上所有試劑均為分析純，無需進一步純化可直接使用。

1.2 實驗儀器

紫外可見分光光度計（UV-1900，美國）；掃描電子顯微鏡（SEM，EVO18，德國）；凝膠滲透色譜儀（GPC，Agilent 1200，美國）；旋轉蒸發(fā)器（REE-52AA，上海）；氣浴恒溫振蕩器（THZ-C，金壇成輝儀器）等。

1.3 木質素酚化改性

按照文獻[10]從黑液中提取桉堿木質素并用濃硫酸純化，稱取2 g純化后的桉堿木質素粉末，加入20 g的間苯二酚（或連苯三酚）混合均勻，再加入15 mL丙酮使其溶解。然后使用旋轉蒸發(fā)器除去丙酮，在室溫下加入40 g 的72%濃硫酸，攪拌反應1 h。反應后過濾，并用大量蒸餾水反復洗滌至中性，干燥后研磨得到木質素間苯二酚（或木質素連苯三酚）。

1.4 酚化木質素乙酰化

分別稱取1 g 上述制備的木質素間苯二酚（或木質素連苯三酚）與10 mL 乙酰化試劑（乙酰氯與冰醋酸體積比為1∶4），充分混合均勻，在40℃的密閉環(huán)境下反應2 h。反應結束后于50℃條件下水浴至溶劑揮發(fā)，再加入少量蒸餾水超聲清洗5 min，過濾，反復沖洗3～4次，于50℃烘箱低溫干燥，研磨得到乙酰化二酚(或乙酰化三酚)[11]。

1.5 木質素對纖維素酶的吸附

準確稱取50 mg酚化木質素，依次加入2 mL纖維素酶液和18 mL pH 值為4.8 的乙酸-乙酸鈉緩沖液，超聲5 min 使其混合均勻。將盛有上述樣品的離心管置于50℃、180 r/min 的氣浴恒溫振蕩器，分別于1、3、6、12、24 h 取樣，在轉速為5000 r/min 下離心10 min，分離得到的沉淀物于35℃烘箱低溫干燥。上清液用0.45 μm 濾膜過濾，以考馬斯亮藍為顯色劑，在595 nm 處測定紫外吸光度值，根據(jù)繪制的“吸光度(y)-蛋白質濃度(x，g/L)”曲線方程（y=12.523x+0.0567，R2=0.9994）計算纖維素酶蛋白含量[12]，用不加纖維素酶的溶液作為空白組。采用相同的方法測乙酰化改性的酚化木質素對纖維素酶的吸附量。吸附量（mg/g）及吸附率（%）計算分別見式（1）和式（2）。

1.6 纖維素酶的脫附及再吸附

移取1.5 中吸附反應3 h 離心后干燥的沉淀物，加入pH 值10 的乙酸-乙酸鈉緩沖液，超聲混合均勻，于50℃、180 r/min 的氣浴恒溫振蕩器反應3 h，離心后測上清液中酶蛋白含量[12]。采用1.5 中相同步驟測沉淀物對纖維素酶的重復吸附率。脫附率（%）及重復吸附率（%）計算分別見式（3）和式（4）。

1.7 被吸附纖維素酶的濾紙酶活

選取1.5 中吸附3 h 時離心后干燥的沉淀物，依次向離心管中加入50 mg 定性濾紙條和1.5 mL pH 值4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液，于50℃、180 r/min的氣浴恒溫振蕩器中振蕩30 min。離心后上清液用0.25 μL濾膜過濾，用3,5-二硝基水楊酸(DNS)作為顯色劑，在540 nm 處測定紫外吸光度值。根據(jù)繪制的“吸光度(y)-葡萄糖濃度(x，g/L)”曲線方程：y=2.9011x-0.1487，R2=0.9993，計算濾紙酶活[13]，并根據(jù)式（5）計算吸附酶活保留率（%）。

1.8 SEM分析

采用掃描電子顯微鏡對木質素微觀形貌進行表征。

1.9 物化性質表征

1.9.1 相對分子質量的測定

采用配備Shodex KF-803L柱的凝膠滲透色譜儀測定酚化木質素相對分子質量。流動相四氫呋喃作為洗脫液，流速為1.0 mL/min，注射體積為100 μL。

1.9.2 表面電荷的測定

根據(jù)文獻[14]測定不同酚化木質素的表面電荷。

1.9.3 酚羥基含量測定

酚羥基含量=總酸基團含量-羧基含量[15]

總酸基團含量的測定：稱取約40～60 mg 酚化木質素m1，加入5 mL 0.1 mol/L NaOH 和2 mL 乙醇，85℃下水浴30 min。水浴結束后立刻加入1 mL 10%BaCl2，冷卻后定容至25 mL，離心取15 mL 上清液于預先盛有5 mL 0.1 mol/L HCl 的錐形瓶中，加入5 滴甲基紅-亞甲基藍混合指示劑，用0.01 mol/L NaOH 標準溶液滴定，記錄滴定前后的體積差V1。總酸基團含量（mol/g）計算見式（6）。

羧基含量的測定：稱取40～60 mg酚化木質素m2，加入20 mL 0.2 mol/L 醋酸鈣溶液，85℃下水浴30 min，定容至25 mL。過濾，取20 mL 濾液于錐形瓶中，加入5 滴甲酚紅-百里酚藍混合指示劑，用0.01 mol/L NaOH 標準溶液滴定，記錄滴定前后的體積差V2。羧基含量（mol/g）計算見式（7）。

2 結果與討論

2.1 木質素對纖維素酶的吸附

本研究探討了不同側鏈結構的酚化木質素對纖維素酶的吸附作用效果以及酚羥基含量與木質素對纖維素酶吸附影響的關系，結果見圖1。從圖1 可以看出，纖維素酶的吸附在24 h 達到平衡，木質素間苯二酚和木質素連苯三酚的最大吸附量分別為842.1 mg/g 和911.4 mg/g。已知文獻報道木質素的酚羥基含量與木質素對纖維素酶的吸附能力具有正相關性[2]。從圖1 可以看出，木質素連苯三酚對纖維素酶的吸附能力強于木質素間苯二酚，這可能是由于木質素不同的化學結構造成的，因為理論上在相同的酚化反應條件下，木質素連苯三酚的酚羥基含量高于木質素間苯二酚。從圖1中還可以看出，與酚化木質素相比，乙酰化后的酚化木質素對纖維素酶的吸附能力大幅降低。主要是因為乙酰化能夠去除大部分的酚羥基，從而導致乙酰化改性的酚化木質素對纖維素酶的吸附作用顯著降低。從而進一步證明了酚羥基含量的變化影響木質素對纖維素酶的吸附作用。

圖1 木質素對纖維素酶的吸附能力

2.2 纖維素酶的脫附及再吸附

圖1中所示在3 h前木質素間苯二酚和木質素連苯三酚對纖維素酶的吸附速率最快，3 h時其吸附量分別從194.9 mg/g 和259.6 mg/g 提 高 到369.6 mg/g 和513.5 mg/g。因此，選取3 h時吸附纖維素酶的酚化木質素作進一步研究。將吸附纖維素酶的酚化木質素分散在pH值為10的緩沖液中，被吸附的纖維素酶發(fā)生脫附行為。Saini等人[3]研究表明調節(jié)pH值有利于被吸附纖維素酶的分離，這主要是因為當pH值升高時可以顯著改變木質素的表面電荷，帶負電荷的纖維素酶和木質素之間的斥力增強，從而減少了纖維素酶的非生產(chǎn)性結合。改變pH值可以促進被吸附纖維素酶與木質素表面的分離，因此是一種經(jīng)濟可行的促進纖維素酶回收利用的方法。

圖2 酚化木質素對纖維素酶的脫附與再吸附

圖3 桉堿木質素及酚化木質素的SEM圖

纖維素酶的脫附率以及被吸附纖維素酶的酶活保留率如圖2 所示。從圖2 可以看出，木質素間苯二酚和木質素連苯三酚對纖維素酶的脫附率分別為57.3%和30.2%，其重復吸附率分別為第一次吸附能力的72.3%和26.9%。與初始酶活相比，被木質素間苯二酚和連苯三酚吸附的纖維素酶的酶活保留率分別為57%和38%。結果表明，更少的纖維素酶從木質素連苯三酚中釋放，是因為木質素連苯三酚中含有更多的酚羥基使負電荷增加，導致被吸附的纖維素酶因較強的靜電力而增加，從而使吸附的纖維素酶難以釋放。且與木質素連苯三酚相比，木質素間苯二酚對纖維素酶的酶活影響相對較小。

2.3 SEM表征

圖3 為桉堿木質素及酚化木質素的SEM 圖。從圖3 可以看出，酚化木質素表面形態(tài)有較大的變化。桉堿木質素并未表現(xiàn)出微球結構，而木質素間苯二酚和木質素連苯三酚均有微球結構，且木質素連苯三酚的微球粒徑比木質素間苯二酚的小。從圖3（b）和圖3（c）均可觀察到顆粒的表面布滿了微孔，微孔孔徑小而密。木質素分子主要表現(xiàn)為細小的顆粒，而且顆粒表面存在一些小孔，這為其物理性吸附提供了可能。

2.4 木質素的物化性質

為進一步解釋木質素間苯二酚和木質素連苯三酚對纖維素酶吸附作用的差異，本研究分別對兩種酚化木質素進行了物理化學性質分析表征。

采用凝膠滲透色譜法對桉堿木質素及酚化木質素的相對分子質量分布進行了分析，結果如圖4 所示。從圖4可以看出，木質素連苯三酚的數(shù)均相對分子質量（Mn）和質均相對分子質量（Mw）均略高于木質素間苯二酚，說明木質素連苯三酚解聚較為嚴重。木質素間苯二酚和連苯三酚的相對分子質量分散指數(shù)（PD=Mn/Mw）值均低于桉堿木質素。結果表明，木質素的PD 值與纖維素酶吸附能力成反比[16]。木質素的PD 值越低，相對分子質量越大，對纖維素酶的吸附親和力越高。因此，相對分子質量和PD 值是導致兩種酚化木質素對纖維素酶吸附能力不同的原因之一。

圖4 木質素的相對分子質量及其分布

本研究測定了酚化木質素表面電荷、羧基含量和酚羥基的含量，結果見表1。從表1 可以看出，桉堿木質素、木質素間苯二酚和木質素連苯三酚的表面電荷分別為-0.83、-1.27、-0.41 mmol/g，木質素間苯二酚表面負電荷高于木質素連苯三酚。結合圖1可知木質素間苯二酚對纖維素酶的吸附能力較低。原因是因為酚化木質素表面負電荷越大，與纖維素酶的靜電斥力越強，從而導致對纖維素酶的吸附親和力降低[17]。與木質素間苯二酚相比，木質素連苯三酚的酚羥基含量更多，吸附能力更強，說明酚羥基含量越高，木質素與纖維素酶吸附親和力越強。結合對纖維素酶吸附結果，通過物理化學檢測可知，酚化木質素的相對分子質量、表面電荷和酚羥基含量對纖維素酶的吸附作用效果均有影響，且酚羥基含量在木質素對纖維素酶的吸附中起著極其重要的作用。

表1 木質素的物理化學性質

3 結 論

本研究以間苯二酚和連苯三酚為酚化試劑，分別對桉堿木質素進行了酚化改性以增加酚羥基的含量，比較了不同側鏈結構的酚化木質素對纖維素酶吸附的影響。

3.1 酚化改性后，木質素間苯二酚和木質素連苯三酚對纖維素酶的吸附能力均高于桉堿木質素，對纖維素酶的最大吸附量分別為842.1 mg/g和911.4 mg/g，表明酚羥基含量增加可提高木質素對纖維素酶的吸附能力。

3.2 木質素間苯二酚與木質素連苯三酚的脫附率分別為57.3%和30.2%，表明被吸附的纖維素酶更容易從木質素間苯二酚中釋放。

3.3 被木質素間苯二酚和木質素連苯三酚吸附的纖維素酶的酶活保留率分別為57%和38%。