血清miR-21在食管鱗癌中的表達及臨床意義

鄭志偉，朱輝德，方玫玫，蔡曉銳，朱志偉，陳 蕾

食管癌是潮汕地區發病率最高的惡性腫瘤之一，調查研究顯示[1]，2003年汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院住院患者前10位的疾病譜中，食管癌在住院病種中排名第一，而且其構成比比排名第二名的鼻咽癌高出7.9%，由此可見，食管癌仍較嚴重地威脅著當地居民身體健康。如何早期檢查和發現食管癌患者，尋找食管癌的防治對策，成為困惑臨床的一個關鍵問題。近年來血清中循環微小RNA(microRNA,miR)的研究逐步顯示其作為生物標志物的潛能，外周血miRNAs可能是一種理想的腫瘤標志物，因其取材方便，顯著的腫瘤相關性、組織特異性和表達穩定性，可以應用于食管癌的早期診斷、治療和預后的評估[2-3]。本研究選擇了miR-21作為目標基因，通過實時熒光定量PCR檢測miR-21在食管鱗癌中的表達，結合患者臨床資料進行統計分析，探索及分析miR-21作為食管鱗癌診斷及預后標志物的潛力。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年10月—2017年6月汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院食管鱗癌患者50例和健康體檢者50例。食管鱗癌患者均由本院取病理組織活檢證實，其中男性38名，女性12名，年齡(57.28±8.42)歲。納入病例標準：①符合食管鱗癌診斷標準；②確診后在我院接受至少連續2次的輔助或新輔助化療，且化療前后已進行相關實驗室檢查；③有相關的影像學、內鏡資料可進行腫瘤分期確定。正常對照組為50名性別、年齡相匹配的在本院健康體檢中心進行體檢的人員，對照組人員均接受血液學檢查、胸片、腹部超聲、大小便常規等檢查，未發現任何異常。其中男性35名，女性15名，年齡(55.45±5.97)歲。所有受試者空腹靜脈采血5 mL，12 500 r/min離心15 min，分離血清于-80 ℃冰箱保存備用。所有入選病例均詳細采集性別、年齡、腫瘤位置、臨床分期、淋巴結轉移及遠處器官轉移情況、家族史、長期煙酒史資料。本研究經汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2 主要儀器和試劑 AvantiTM30低溫高速離心機：美國Beckman公司；普通PCR儀：德國Eppendorf公司；Engine Opticon 2熒光定量儀：加拿大MJ Research公司；miR-21引物：蘇州吉瑪基因有限公司；miRNAs提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScript逆轉錄試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；SYBR?Premix：天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 血清miRNAs提取 前期收集病例組與對照組血清樣本，血清總miRNAs提取具體步驟參照TIANGENmiRcute miRNA提取分離試劑盒說明書，最后提取出血清總miRNAs溶解于30 μL RNase-FreeddH2O，-80 ℃冰箱保存待檢測。

1.4 血清miR-21檢測 使用TIANGEN逆轉錄試劑盒在所提取的miRNA 3′末端加上多聚A尾，即Poly(A)，再使用Oligo(dT)-universal tag通用逆轉錄引物對miRNA進行逆轉錄反應，可生成對應的cDNA，接下來利用合成miR-21特異性引物，miR-21引物上游：5-CT-CAACTGGTGTCGTGGAGTCG3′；下游:5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTT-3′;使用美國Applied Biosystems公司ABI 7500PCR儀進行熒光定量檢測，反應體系為20 μL。模式：94 ℃ 2 min，94℃ 20 s，60 ℃ 35 s，40個循環，最后一步做溶解曲線，設置為55～95 ℃，0.5 ℃/s，運行儀器，進行PCR擴增。反應完成后，記錄下各反應管Ct值。若復孔間Ct值之差>1，需重復實驗，取2復孔Ct值平均值進行統計分析。實時熒光定量PCR程序結束后，設定熒光閾值，設置的原則是要大于樣本的熒光背景值(前15個循環信號)，同時要盡量選擇進入指數期的最初階段，使真正的信號是超過域值的熒光信號，從而得到各組PCR擴增反應的Ct值。取各miRNA的平均Ct值，采用參照基因△Ct法分析，以內在看家基因U6 snRNA表達Ct值作為內參標準，通過2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平，計算公式為：2-(miRNAs-U6)。

2 結果

2.1 食管鱗癌患者血清miR-21表達水平 食管癌患者血清中miR-21相對表達量為10.56±4.30，正常對照組血清中miR-21相對表達量為1.19±6.72，miR-21在食管鱗癌患者血清中表達水平明顯高于健康人群，差異比較具有統計學意義(P<0.001)。

2.2 食管鱗癌患者血清中miR-21表達水平與臨床病理特征之間的相關性 通過對不同性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期、煙酒史、家族史的食管鱗癌患者外周血miR-21表達水平進行對比分析，結果表明在食管鱗癌患者中，miR-21表達水平與腫瘤位置、TNM分期、是否發生淋巴結轉移及遠處器官轉移具有顯著的相關性。相對于胸上段的食管鱗癌患者，胸中、下段患者血清miR-21表達明顯上調(P<0.05)；已發生淋巴結轉移及遠處轉移的食管鱗癌患者血清miR-21表達水平明顯高于其他患者(P<0.001)；臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的患者血清miR-21表達水平較Ⅰ、Ⅱ期患者明顯上調(P<0.05)。而miR-21的表達水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤家族史、煙酒史等無明顯相關性(P>0.05)。表1。

表1 miR-21表達水平與臨床病理特征之間的相關性

注：*P<0.05，△P<0.001

3 討論

食管癌是我國的十大癌癥之一，其死亡率在我國癌癥總死亡率中占第四位[4]。據GLOBOCAN 2012數據顯示，2012年度全世界67億人口新發食管癌48.2萬例，發病率為7.0/10萬，居全部惡性腫瘤第9位；死亡40.7萬例，死亡率5.8/10萬，居第8位。中國大陸13.4億人口食管癌新發25.9萬例，發病率為16.7/10萬，居全國各類惡性腫瘤第5位；死亡21.1萬例，死亡率為13.4/10萬，居第4位[5]。目前臨床上大部分有臨床癥狀的食管癌患者，就診時病變已處于中晚期，失去早期治療的機會，一般中晚期患者術后五年生存率僅為10%～30%，而早期食管鱗癌術后5年生存率則可達80%～90%[6]，因此，如何提高食管癌的早期診斷，盡早治療對提高食管癌患者生存率具有重要意義。

MicroRNAs是一類高度保守的內源性單鏈非編碼RNA，通過與靶基因3′端非編碼區發生不完全配對，從而調節靶基因mRNA翻譯、轉錄過程，參與轉錄后基因表達調控。miRNA在組織、細胞、外周血中的表達有顯著的腫瘤相關性、組織特異性和表達穩定性[7]，作為致癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發生、發展，有望成為新的生物標志物。我們通過文獻的檢索和前期實驗研究[8-9],發現miR-21在多種腫瘤中均表達升高，基于提高特異性的考慮，我們聯合選取miR-21作為候選檢測的miRNA，以前人的研究作為基礎，結合潮汕地區食管鱗癌高發的情況，通過檢測血清miR-21在食管鱗癌患者中的表達，探討miR-21表達在食管鱗癌中的臨床意義。結果表明，miR-21在食管鱗癌患者血清中的表達水平較健康對照者均顯著上調(P<0.001)，這一結果與上述基因在食管腫瘤組織與正常組織間表達失調的情況相符[10]，提示血清miR-21有作為食管鱗癌分子診斷標志物的潛力。本研究還發現，miR-21的表達水平還與食管鱗癌患者遠處器官轉移及淋巴結轉移情況明顯相關：食管鱗癌伴遠處器官轉移的患者血清miR-21表達水平分別是不伴遠處轉移患者的2.0倍(P<0.05)，而伴淋巴結轉移的患者上述基因表達水平均為其他患者的1.6倍(P<0.05)。此外，不同臨床分期的食管鱗癌患者血清miR-21的表達水平也呈現出明顯的差異：臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的患者血清miR-21表達水平分別為Ⅰ、Ⅱ期患者的1.5倍(P<0.05)。研究結果表明miR-21具有成為食管鱗癌預后生物標志物的極大潛力。本研究還發現miR-21表達水平還與食管腫瘤的位置明顯相關(P<0.05)，而不同位置的食管腫瘤治療方法也不盡相同，解剖結構的特殊性使得胸上段食管鱗癌的患者手術治療的可能性與胸中、下段腫瘤患者相比較小。因此，miR-21表達水平還可能對提示腫瘤位置、選擇治療方式具有參考意義。此外，本研究未發現miR-21的差異表達與年齡、性別、腫瘤家族史、長期煙酒史等因素有明確關聯(P>0.05)。

本研究的樣本仍然較少，在今后的工作中將進一步加大樣本量，取得更可靠的實驗結果，為食管癌的早期診斷找到有價值的血清指標，并進一步研究miR-21在食管鱗癌中的基因調控網絡機制。