4-羥基他莫昔芬通過抑制DNMT1/DNMT3A表達逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌細胞間質(zhì)表型

王一丁，汪 茜

乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，隨著治療手段的不斷進步，乳腺癌患者生存期逐漸延長。然而三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)在各組亞群中呈間質(zhì)樣表型，較激素受體(hormone receptor，HR)陽性乳腺癌具有更強的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而侵襲轉(zhuǎn)移是影響晚期乳腺癌患者生存的主要因素[1]。因此，改變TNBC的間質(zhì)表型成為延長TNBC患者生存期的重要途徑。越來越多的學者認為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在乳腺癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[2-4]，而找到EMT的調(diào)控機制并且逆轉(zhuǎn)這一過程，成為近年來乳腺癌的研究熱點。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體(estrogen receptor,ER)拮抗劑4-羥基他莫昔芬(4-Hydroxytamoxifen，4-OHT)在TNBC中具有逆轉(zhuǎn)EMT的作用，能夠提高TNBC的藥物敏感性。

隨著EMT機制的深入研究及上游調(diào)控通路的深入挖掘，微小RNA(microRNAs，miRNA)逐漸成為上游調(diào)控EMT的研究熱點[5-6]。早期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200家族(miR-200s)能夠在EMT的過程中受到明顯抑制，提示miR-200s是抑制EMT的主要調(diào)節(jié)因子；miR-200c是miR-200s中的重要成員，在ER狀態(tài)不同的乳腺癌細胞表達中具有顯著差異[7]。很多研究報道恢復miR-200c的表達能夠維持細胞的上皮表型，抑制間質(zhì)表型調(diào)控EMT[8]。

MiRNA的序列是呈高度保守性的，然而表觀遺傳學的因素能夠在不改變基因序列的前提下對其進行表觀修飾，影響miRNA靶基因的轉(zhuǎn)錄及表達[9]。甲基化是表觀遺傳學的重要研究內(nèi)容，能夠調(diào)控基因的表達、對蛋白質(zhì)及核酸進行修飾[10]。甲基化的過程需要甲基化轉(zhuǎn)移酶催化完成。一項在結(jié)直腸癌細胞中進行的研究發(fā)現(xiàn)，干擾甲基化轉(zhuǎn)移酶表達，能夠使10%的miRNA表達受到影響，證實DNA甲基化是調(diào)控miRNA的重要機制之一[11]。而對于miR-200c啟動子特異位點的甲基化，也逐漸成為研究熱點。有研究認為，在誘導細胞發(fā)生EMT的過程中，miR-200c啟動子發(fā)生甲基化，部分功能受到抑制，導致原癌基因C-myb及zeb1的表達升高[12]。本研究旨在探討4-OHT通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)1和DNMT3A表達逆轉(zhuǎn)TNBC細胞的EMT作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；4-OHT購于美國Sigma公司；胎牛血清購于天津血液病研究所；ER-α，PR，人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)，Vimentin抗體購于美國Cell Signalling Technology公司；DNMT1、DNMT3A、Actin等其他抗體購于美國Santa Cruz公司；羊抗鼠和羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司；ECL試劑盒購于PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 選擇乳腺癌細胞株MDA-MB-231、具有上皮樣表型的HR陽性乳腺癌細胞MCF-7和經(jīng)阿霉素長期培養(yǎng)的阿霉素耐藥細胞株MCF-7/ADR，檢測ER、PR及HER-2表達，明確3種細胞系分型。乳腺癌細胞株MDA-MB-231生長于含有10%滅活胎牛血清、12 U/mL慶大霉素的L15培養(yǎng)液中；MCF-7細胞生長于含有10%滅活胎牛血清、12 U/mL慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中；MCF-7/ADR細胞生長于含有10%滅活胎牛血清、12 U/mL慶大霉素、1 μmol/L阿霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，維持阿霉素耐藥性，均于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化液消化傳代，2～3 d傳代1次。所有實驗均采用對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 Western Blot 檢測蛋白水平 分別收集3種細胞系細胞1×107個，將其裂解于200 μL含有蛋白酶抑制劑(100 μg/mL PMSF，2 μg/mL Aprotitin)的RIPA裂解液中[0.1%SDS，1% Trito-100，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA(pH=8.0)，10 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)]，4 ℃裂解40 min，13 000 r/min離心取上清，蛋白定量。與3×樣品緩沖液混合后，煮沸5 min。將樣品(30 μg/道)在10%的SDS-聚丙烯凝膠中進行電泳3 h，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上(電壓：2 mV/cm2；時間：120 min)。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，按預染Marker標記的分子量剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入兔抗人ER-α抗體(1∶1 000)、PR抗體(1∶1 000)、HER-2抗體(1∶1 000)、Vimentin抗體(1∶1 000)、DNMT1抗體(1∶1 000)、DNMT3A抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶1 000) 4 ℃過夜。TTBS洗4次后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠(1∶800)或羊抗兔二抗(1∶800)室溫作用30 min，ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析處理。

1.2.3 實時定量PCR檢測miR-200c相對表達量 細胞總RNA的提取:收集各實驗組細胞，按TRIzol試劑盒說明提取RNA,Nanodrop鑒定RNA質(zhì)量并在260/280 nm測其濃度。RNA逆轉(zhuǎn)錄過程采用One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Kit(Takara,Japan)法；miRNA的相對表達量采用comparative cycle threshold(Ct)法；U6 small nuclear RNA為內(nèi)參；miR-200c特異性引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTAATACTGCCGGGTAA-3′；U6引物序列：正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；試劑盒中包含Uni-miR qPCR引物；采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Perfect Real Time) (Takara,Japan)檢測miRNA相對表達量；PCR條件為：95 ℃，25 s，95 ℃，5 s，58 ℃，34 s，共45個循環(huán)；采用threshold cycle和2-ΔΔCt法計算miRNA相對表達量，實驗重復3次。

1.2.4 4-OHT作用于乳腺癌細胞 前期研究及大量文獻證實miR-200c在EMT中的重要調(diào)控作用。將3種乳腺癌細胞MCF-7、MCF-7/ADR和MDA-MB-231鋪板過夜，應用5 μmol/L的4-OHT作用(實驗組)MDA-MB-231、MCF-7/ADR和MCF-7細胞2 d后，應用實時定量PCR技術檢測miR-200c的表達，將未應用4-OHT作用(對照組)MDA-MB-231、MCF-7/ADR和MCF-7細胞的miR-200c表達量作為100%，分析實驗組在藥物作用后miR-200c表達的相對變化。

1.2.5 CpG島預測 通過MethPrimer在線引物設計工具頁面:http://www.urogene.org/methprimer[13]，輸入miRNA啟動子的序列，得到CpG島預測結(jié)果。

1.2.6 4-OHT作用于MCF-7/ADR細胞影響DNMTs表達 4-OHT作用于MCF-7/ADR細胞3 d，檢測DNMT1和DNMT3A蛋白表達情況；應用瞬時轉(zhuǎn)染干擾RNA表達，單獨及聯(lián)合敲除DNMT1、DNMT3A后應用實時定量PCR技術檢測miR-200c表達變化；應用4-OHT作用于聯(lián)合敲除DNMT1、DNMT3A的MCF-7/ADR細胞后，Western Blot方法檢測EMT相關間質(zhì)表型標記物Vimentin的變化。

2 結(jié)果

2.1 3種乳腺癌細胞中激素狀態(tài)/HER-2表型及miR-200c表達情況 如圖1A所示，MCF-7為HR受體陽性，HER-2陰性乳腺癌細胞；而經(jīng)過阿霉素長期培養(yǎng)的MCF-7/ADR細胞株的HR受體轉(zhuǎn)為陰性，ER-α、PR及HER-2表達呈三陰性；MDA-MB-231乳腺癌細胞激素受體狀態(tài)同MCF-7/ADR。應用實時定量PCR檢測3種細胞中miR-200c的表達，具有間質(zhì)樣表型的TNBC細胞MCF-7/ADR、MDA-MB-231細胞中miR-200c表達顯著低于HR受體陽性的MCF-7細胞(圖1B)。

2.2 4-OHT作用于乳腺癌細胞其miR-200c相對表達變化 MDA-MB-231和MCF-7/ADR細胞在4-OHT作用后miR-200c表達分別升高(21.6±8.56)倍和(6.98±2.15)倍，差異比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MCF-7細胞在4-OHT作用前后miR-200c表達差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。圖2。

圖1 3種乳腺癌細胞中激素狀態(tài)/HER-2表型及miR-200c表達情況

圖2 4-OHT作用于乳腺癌細胞其miR-200c相對表達變化

2.3 CpG島預測軟件分析miR-200c基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài) 利用CpG Island預測軟件分析miR-200c基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，藍色區(qū)域表示CpG島富集區(qū)。經(jīng)軟件預測在miR-200c基因序列之前富含有CpG島。圖3。

圖3 miR-200c啟動子區(qū)CpG島分布圖

2.4 應用4-OHT作用于MCF-7/ADR細胞DNMT1和DNMT3A表達情況 應用4-OHT作用于MCF-7/ADR細胞3 d，檢測DNMT1和DNMT3A蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)在4-OHT作用下DNMT1和DNMT3A表達均有下調(diào)(圖4A)；進一步在MCF-7/ADR細胞中敲除DNMT1或DNMT3A的表達并進行實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-200c表達差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而同時敲除DNMT1和DNMT3A的表達，miR-200c表達上調(diào)(1.87±0.12)倍，差異比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4B，4C)。敲除DNMT1和DNMT3A的表達后檢測EMT指標的變化，發(fā)現(xiàn)同時敲除DNMT1和DNMT3A后Vimentin表達下調(diào)，類似于4-OHT的作用，而在此基礎上應用4-OHT能夠更顯著的逆轉(zhuǎn)EMT(圖4D)。

圖4 4-OHT作用于MCF-7/ADR細胞影響DNMTs表達

3 討論

TNBC具有更強的侵襲轉(zhuǎn)移能力，很快發(fā)生復發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥，目前的治療仍缺乏有效的靶向及內(nèi)分泌藥物，患者面臨高復發(fā)風險及短暫的生存期。研究顯示，部分TNBC呈現(xiàn)間質(zhì)表型。有研究證實miR-200c在乳腺癌、非小細胞肺癌和膀胱癌等多種實體腫瘤中與EMT存在緊密聯(lián)系[14-16]。我們前期研究經(jīng)過miRNA芯片篩查發(fā)現(xiàn)在TNBC和非TNBC 2種細胞系中miR-200c表達差異顯著[17]，說明miR-200c與三陰狀態(tài)也存在密切聯(lián)系[18]。Park等[19]研究結(jié)果表明在子宮內(nèi)膜癌細胞中，4-OHT能夠通過miR-200c上調(diào)c-myc促進子宮內(nèi)膜癌上皮細胞發(fā)生EMT，從而導致細胞侵襲能力增強，這證實了4-OHT與miR-200c之間存在的聯(lián)系。本研究中miR-200c在TNBC細胞中表達顯著低于非TNBC細胞，而在TNBC細胞中應用4-OHT后miR-200c表達升高，可能是4-OHT部分解除了miR-200c受到的抑制作用。

DNMT是DNA甲基化發(fā)生的必要催化酶，DNMT的活性及表達程度能夠影響基因的甲基化狀態(tài)[20]。近年來越來越多研究報道，在多種腫瘤中DNMTs的上調(diào)與不良預后相關[21]。降低DNMTs的活性能夠影響甲基化的狀態(tài)[22]。一項在結(jié)腸癌中的研究報道[23]，應用RNAi單獨干擾任意一種DNMT都不能影響miRNA的表達，但同時敲除2種蛋白能夠調(diào)控10%miRNA的表達，深入探究發(fā)現(xiàn)這些有變化的miRNAs，其啟動子區(qū)域均有CpG島存在。本研究對miR-200c的啟動子進行了CpG島的預測，證實miR-200c的啟動子區(qū)存在甲基化的位點。接著，應用4-OHT作用于間質(zhì)樣TNBC細胞，檢測DNMTs的表達，發(fā)現(xiàn)DNMT1、DNMT3A表達降低。進一步在DNMTs高表達的MCF-7/ADR細胞中敲除DNMTs，發(fā)現(xiàn)同時敲除DNMT1和DNMT3A能夠上調(diào)miR-200c的表達，且能夠降低間質(zhì)表型Vimentin的表達。

綜上所述，本研究通過深入研究4-OHT對于間質(zhì)樣TNBC細胞的作用機制，證實了4-OHT對DNMTs表達的調(diào)控，通過調(diào)控DNMTs表達發(fā)揮全面去甲基化作用調(diào)控miR-200c的表達，從而逆轉(zhuǎn)間質(zhì)樣表型的表達，為進一步尋找4-OHT非雌激素受體依賴機制提供科學依據(jù)，具有一定臨床意義。對miR-200c啟動子上的甲基化位點進行特異性檢測有待進一步深入的研究。