SP110基因過表達慢病毒載體的構(gòu)建與包裝

賈鵬霞，劉丙雨，李新月，張萬江，程 江，吳江東，馬雅靜

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的慢性傳染性疾病，目前仍是危害人類健康的重要疾病之一，研究結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展顯得尤為重要。2005年,有學(xué)者通過動物實驗發(fā)現(xiàn)了一種能調(diào)節(jié)結(jié)核病先天免疫力的新基因—細胞內(nèi)病原體抗性基因1(intracelluar pathogen resistance1,Ipr1)[1]。而在人體中與Ipr1蛋白最接近的同源蛋白就是核體蛋白SP110b，故研究者們提出SP110基因可能是與人體結(jié)核病易患性相關(guān)的一個新候選基因。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步，目前調(diào)整基因表達水平的手段逐漸成熟。利用慢病毒載體導(dǎo)入外源性基因的方法因具有轉(zhuǎn)染效率高且能穩(wěn)定表達等優(yōu)點備受學(xué)者青睞。本研究通過合成SP110基因片段并通過PCR法進行鏈接獲得SP110全長序列，經(jīng)測序驗證成功后與穿梭質(zhì)粒LV5構(gòu)成重組質(zhì)粒，再與包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)重組形成穩(wěn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)，共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，為進一步探討SP110基因在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中的作用提供工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 293T細胞株由本實驗室保存；dsDNA oligo由上海吉瑪公司合成；慢病毒穿梭質(zhì)粒LV5和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶Not I和Nsi I(日本TaKaRa公司)；大腸桿菌感受態(tài)DH5α由本實驗室制作；DNA連接酶(美國NEB公司)；96孔板(天根生化科技有限公司)。

1.1.2 實驗試劑 RNAi-Mate(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)、DMEM培養(yǎng)基(天根生化科技有限公司)；雙抗(青霉素/鏈霉素原液)購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；E.Z.N.A.膠回收試劑盒和E.Z.N.A.TM質(zhì)粒提取試劑盒(美國Omega公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 THP-1細胞培養(yǎng) 人單核巨噬細胞THP-1用含10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素(100 U/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，根據(jù)細胞的生長情況進行傳代，當(dāng)培養(yǎng)至對數(shù)期時收集細胞用于后續(xù)實驗。運用Trizol法提取THP-1細胞中的總RNA，在ThermoNanodrop濃度分析儀上測定總RNA濃度，然后利用cDNA合成試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SP110基因獲取 美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫獲得人源性SP110基因全長編碼序列，根據(jù)Gen Bank設(shè)計目的基因引物SP110-Not I-F：5′-AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCGCCACCATGTTCACCATGACAAGAGCCATG；SP110-Nsi I-R:5′-GATCCATCCCTAGGTAGATGCATTCACTTGCTATTTAACTCTCTCTTGAGATTTATTCTTGGA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)，目的基因上下游引物分別加上LV5載體上Not I和Nsi I兩側(cè)同源序列，用于載體的亞克隆。用1.2.1中已合成的cDNA為模板經(jīng)過PCR擴增(PCR循環(huán)參數(shù):95 ℃ 30 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min)反應(yīng)完成后，利用Agarose電泳并切膠回收Homo SP110基因片段。

1.2.3 V-SP110重組質(zhì)粒構(gòu)建擴增和鑒定 使用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和NsiⅠ線性化LV5載體(37 ℃酶切2 h)，電泳，用DNA凝膠回收試劑盒回收載體LV5，利用ClonExpress?Entry One Step Cloning Kit，將擴增好的片段，重組克隆到線性化的LV5載體中，輕輕混勻各組分，置于37 ℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)完成后立即將反應(yīng)管置于冰水浴中，冷卻5 min。連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基篩選后，挑取單克隆并擴大培養(yǎng)以進行質(zhì)粒酶切鑒定，DNA測序鑒定獲取重組質(zhì)粒V-SP110。

1.2.4 重組慢病毒及陰性對照慢病毒的包裝和濃縮 轉(zhuǎn)染前1 d將生長狀態(tài)良好的293T細胞用胰酶消化重懸接種于15 cm細胞培養(yǎng)皿中，加入18 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，混勻后37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)過夜，待細胞密度達到60%時，將重組慢病毒質(zhì)粒V-SP110和pGag/Pol、pRev、pVSV-G混勻再加入300 μL RNAi-Mate，混勻，室溫放置20～25 min；除去15 cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入8 mL無血清的DMEM培養(yǎng)液；將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入15 cm培養(yǎng)皿中，輕輕地前后搖晃培養(yǎng)皿以混勻復(fù)合物，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中溫育4～6 h；吸棄轉(zhuǎn)染液，加入18 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后將培養(yǎng)皿中細胞上清液吸到50 mL離心管中，4 ℃，4 000 r/min，4 min低速離心后，將離心管上清液倒入50 mL注射器內(nèi)用0.45 μm過濾器過濾；濾液在離心機中進行超速離心，4 ℃，20 000 r/min，2 h后收集濃縮液-80 ℃凍存。重組慢病毒命名為LV5-SP110，用上述相同方法將LV5與pGag/Pol、pRev、pVSV-G經(jīng)RNAi-Mate共轉(zhuǎn)染到293T細胞，并包裝成能表達GFP的慢病毒顆粒，命名為:LV5-NC作為陰性對照。

1.2.5 病毒滴度測定 293T細胞在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%～90%融合時，棄去培養(yǎng)液，用3 mL D-Hank’s solution洗滌細胞2次；加1 mL Trypsin-EDTA solution，混勻后，小心吸去胰酶溶液，37 ℃放置3～5 min；再加入2 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，吹打使細胞形成單細胞懸液；按3×104/孔的濃度接種96孔板，混勻后于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h；將慢病毒原液10 μL，用10% FBS的DMEM培液10倍稀釋3～5個梯度(加入終濃度為5 μg/mL的Polybrene)；吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL稀釋的病毒液，同時設(shè)立空白對照組，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h；吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加入100 μL 10% FBS的DMEM培液，于37 ℃ 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h；通過熒光顯微鏡或FACS計數(shù)熒光細胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增SP110序列測序 經(jīng)PCR擴增SP110序列測序目的基因序列全長1 650 bp,測序結(jié)果所示片段為95～1 744 bp，經(jīng)過DNASTAR軟件比對證明擴增片段與目的基因序列一致(圖1)。

黃色截取部分為正測序結(jié)果，紅色部分為反測序結(jié)果圖1 SP110基因測序結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒LV5-SP110的鑒定 將PCR產(chǎn)物與經(jīng)NotⅠ和NsiⅠ內(nèi)切酶線性化的LV5載體連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，提取質(zhì)粒酶切鑒定，酶切后產(chǎn)生了如圖2所示約1 650 bp的片段，片段大小與SP110基因cDNA大小一致。本研究所用慢病毒載體質(zhì)粒LV5(EF-1aF/GFP&puro)圖譜如圖3所示。

圖2 Not I和Nsi I雙酶切鑒定結(jié)果

圖3 LV5(EF-1aF/GFP&puro)的圖譜

2.3 測序鑒定重組質(zhì)粒LV5-SP110 酶切鑒定正確的質(zhì)粒取10 μL送上海生工基因測序。測序結(jié)果與預(yù)期SP110基因序列完全一致，測序證實獲取重組質(zhì)粒V-SP110。結(jié)合上述圖1，圖2結(jié)果證明成功構(gòu)建慢病毒載體。

2.4 經(jīng)293T細胞包裝后慢病毒滴度測定結(jié)果 病毒滴度釆用逐孔稀釋法檢測，利用1、0.1和0.01 μL的慢病毒懸液分別感染293T細胞(3×104/孔)，72 h后觀察細胞熒光情況(圖4)。其中GFP陽性細胞比率為33.3%。經(jīng)計算，慢病毒滴度為104×33.3%/(0.01×10-3mL)=1.0×108TU/mL。慢病毒滴度為1.0×108TU/mL。

A：重組慢病毒LV5-Homo SP110

B：陰性對照慢病毒LV5-NC圖4 慢病毒在不同稀釋濃度下感染293T細胞的結(jié)果

3 討 論

結(jié)核病是由MTB感染引起的人畜共患慢性傳染病，MTB感染者約占世界人口的1/3，其中10%最終發(fā)展為結(jié)核病患者，結(jié)核病是單一致病菌致死率最高的疾病，而我國是結(jié)核病的高發(fā)國家，大量研究已證實結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展與宿主遺傳因素和環(huán)境因素密切相關(guān)。MTB在人體內(nèi)以細胞免疫為主，巨噬細胞是MTB主要的宿主細胞和效應(yīng)細胞，其活性和功能對MTB的免疫應(yīng)答和感染后的轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要。Kramnik等[2]以抗結(jié)核的小鼠和結(jié)核易感的小鼠為模型研究遺傳因素與MTB易感性的關(guān)系，結(jié)果在小鼠1號染色體上鑒定出一個對結(jié)核有重要影響的基因座并將其命名為結(jié)核超易感基因座1(super susceptibility to tubercu losis 1，sst1)。隨后Pan等[1]用同源導(dǎo)入的方法將上述2種品系小鼠的sst1序列區(qū)域進行置換得到轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)結(jié)核易感小鼠對結(jié)核病有了抵抗力。這些轉(zhuǎn)基因小鼠感染MTB后，肺損傷顯著降低，存活時間也明顯長于對照組小鼠。且轉(zhuǎn)基因小鼠巨噬細胞不僅能限制MTB的擴增，細胞的死亡途徑也由壞死轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲鐾緩健＝?jīng)過深入的研究發(fā)現(xiàn)上述對結(jié)核有抵抗力的主要因素為sst1序列中表達的Ipr1基因[3-5]。體外抗菌實驗表明Ipr1基因的表達增強了巨噬細胞殺傷胞內(nèi)吞噬的MTB的能力。其表達可能主要是增強巨噬細胞抗MTB感染固有免疫機制的有關(guān)基因的表達，特別是TLR2/TLR4及與其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的分子以及IFN-γR1、TNFR1的表達，促進巨噬細胞的活化及殺傷胞內(nèi)吞噬的MTB。研究者指出Ipr1基因表達的上調(diào)能有效提高巨噬細胞抗結(jié)核感染的固有免疫能力，而在人類基因組中又存在與小鼠Ipr1基因高度同源的基因SP110b[6-8]，因此，推測Ipr1和SP110可能具有相同的功能，即通過參與激素受體、病原體、干擾素信號間的信息交流介導(dǎo)機體抗胞內(nèi)寄生菌感染的固有免疫[2]。

SP110基因作為人類結(jié)核病易感性相關(guān)的一個新的候選基因目前相關(guān)研究甚少，其在結(jié)核病發(fā)展過程中的作用尚不明確，本研究在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上，采用改變基因表達水平的方法利用慢病毒載體導(dǎo)入外源性基因構(gòu)建SP110過表達的慢病毒載體，并進行病毒包裝，為進一步研究SP110在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展中的作用機制及功能奠定基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，慢病毒載體作為工具備受學(xué)者青睞，慢病毒載體是將人類免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV1)的全部HIV1編碼基因刪除進而改造成的病毒載體系統(tǒng)，能高效地將目的基因?qū)胝婧松锛毎胁㈦S著細胞不斷分裂持久且穩(wěn)定地表達目的基因[9-12]。本研究采用上海吉瑪公司提供的慢病毒表達系統(tǒng)，即1個穿梭質(zhì)粒(LV5)和3個包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)。其中，穿梭質(zhì)粒中包含目的基因的慢病毒骨架及其包裝產(chǎn)生相應(yīng)基因組RNA的所有順式作用元件，可以穩(wěn)定表達目的基因。另外，3個輔助包裝質(zhì)粒可以提供病毒包裝所需的反式作用因子，采用“自我滅活”修飾，阻止子代病毒自我復(fù)制，從而確保慢病毒具備良好的生物安全性。為了使SP110基因能夠在THP-1細胞中穩(wěn)定表達，本研究構(gòu)建了SP110過表達慢病毒，利用PCR擴增得到目的基因SP110，利用DNA連接酶將線性化的LV5載體和目的基因SP110連接，通過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取，重組慢病毒質(zhì)粒酶切鑒定和DNA測序最終鑒定重組質(zhì)粒V-SP110構(gòu)建成功。在包裝質(zhì)粒輔助下，利用293T細胞成功包裝成SP110過表達的慢病毒載體(LV5-SP110)和相應(yīng)的對照載體(LV-NC),為研究其分子機制奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。