基于腐蝕生長算法的不同活力玉米種子根系表型研究

盧 偉 李 也 王 玲 羅 慧 孫國祥 汪小旵

(1.南京農業大學工學院， 南京 210031； 2.江蘇省現代設施農業技術與裝備工程實驗室， 南京 210031)

0 引言

根系是植物吸收水分、養分和礦物質的重要器官[1]，根系形態研究是植物營養、生理、育種和生態學的重要內容[2]。作為世界上產量最多的農作物，玉米既可作為食物，也可作為飼料。玉米的根系是植物的載體，對其環境適應能力如抗水性、抗逆性等特性有很大影響，因此研究玉米的根系構型非常重要。而不同活力的種子的根系在形態學上差異較大，因此，可利用根系表型參數，如根系數目(RTN)、根系長度(RTL)、根系寬度(RTW)、根系延展長度(REL)、根系彎折角(REA)等評價種子活力。

為直觀觀察根系性狀，研究者早期采用發芽紙培養技術，該方法最初用于篩選大豆[3]、玉米[4]、小麥[5]、油菜[6]、珍珠粟[7]等，并采用計算機視覺技術輔助分析，可得到清晰的根系圖像，但根只能在培養紙[8]的表面生長，不能展現出其三維空間結構。為得到根系的3D構型，水培[9]和霧培[10]的方法應運而生，采用這兩種方法，植物根系從二維平面向三維空間延伸，但根系受重力影響下垂嚴重，與土壤中的根系形態存在較大差異。此后，凝膠基質投入使用，透明的凝膠基質可起到支撐植物根系的作用，且易于觀察內部根系構型，但其成分和特性與土壤差異較大，且沒有微生物等，因此難以還原根系的生長環境[11]。上述方法能夠控制培養基的同質性，將觀察到的根系性狀的固有易變性降到最低，也能夠得到清晰的根系圖像，因此利用計算機視覺技術提取植物根系特征是可行的，只是該類方法中植物生長環境與實際土壤環境差異較大。

為獲取根系在土壤中的構型和生長情況，最直接的檢測方法有土壤核[12]和土壤柱等方法，結合機器視覺[14]、光譜成像[15]、激光掃描成像等技術[16]，可提供精確的根系細節，但其工作量大，檢測時間長，且為有損檢測。為實現土壤中根系的無損檢測，根管法[13]和Minirhizotron微根窗技術[23]及其改進方法[24]可對土壤中植物根系某一點生長過程進行連續觀察[25]，在森林[26]、果園[27]、農業生態系統[28]等領域有較廣泛的應用[29]，該方法可實時檢測根系生長狀態，但檢測耗時長，且會打破根系與土壤間的平衡，導致根系大量繁殖，違背植物根系正常發育生長規律，不適于作物根系表型的高通量無損檢測[30]。

為實現根系的原位無損成像[17]，在醫學領域中廣泛應用的X射線計算機斷層掃描技術[18]和核磁共振技術[19]被引入根系表型檢測中，該類方法可獲得清晰、完整的根系立體圖像[20]，但其具有放射性，重復測量會對植物根系造成一定傷害[21]，且設備價格昂貴，無法大規模推廣使用[22]。

為實現土壤中根系的高通量無損檢測，研究者利用透明容器獲取土壤外側植物根系圖像，并采用計算機視覺技術進行土壤表面根系的高通量表型檢測[31]，但由于根系的向水性、向地性和趨暗性，會造成土壤表層根系的斷裂和不完整。針對此問題， CHEN[33]利用神經網絡進行根系斷裂處的修復研究，通過人工繪制大量的植物完整根系和斷裂根系，作為訓練集，采用深度神經網絡進行土壤表面根系斷裂處的修復，驗證了深度神經網絡進行根系斷裂處修復的可行性。但人工繪制的測試集和訓練集過于理想化，難以充分還原植物根系的真實情況，且該算法目前只能用于較小根系斷裂間隙的修復，因此具有一定局限性。

為克服已有方法的不足，獲取土壤中盡可能多的根系表型信息，本文采用薄長方體透明容器作為植物脅迫生長裝置，針對玉米根系的向水性、向地性、連續性等生理特性，提出一種新的玉米根系圖像修復算法，即腐蝕生長算法，并通過對玉米早期根系表型的檢測來驗證算法的有效性。

1 實驗預處理

1.1 植物培養

基于植物根系的向水性、向地性、趨暗性等開發長方體透明脅迫生長裝置，該裝置尺寸為100 mm×20 mm×150 mm，頂部無蓋，底部有8個均勻分布的直徑為3 mm的通孔，用于漏水。在容器內加入黑色土壤(有機質質量比478 mg/kg，N、P、K質量比6.75 mg/kg,益生菌質量比90 μg/kg,微量元素質量比1.7 μg/kg，腐殖酸質量比130 μg/kg，pH值6.5～6.8)，在其中種植黑糯一號(河南上都種子公司)玉米種子，如圖1所示。實驗在南京農業大學工學院(32°18′N, 118°46′E)完成。

圖1 設備圖像Fig.1 Equipment pictures

1.2 圖像獲取

為最大限度消除反光影響，獲取清晰的圖像，采用佳能D600型數碼單反相機(18～135 mm中焦鏡頭，佳能公司)：相機設置為微距模式，快門速度1/3 s，光圈為5 mm，傳感器靈敏度為800 ISO。

將偏振鏡沿光軸放置，通過調整偏振角和兩組偏振片之間的距離消除反光。鏡頭中心、偏振鏡中心和根系培養裝置位于同一水平線上，相機的焦點定焦于植物根系，如圖2所示。

圖2 圖像采集Fig.2 Image capture1.培養皿 2.偏振鏡 3.相機

1.3 實驗步驟

實驗分為4個步驟：

(1)種子老化。將篩選的種子破休眠處理后分為8份，進行人工老化實驗，將每組樣品放置在玻璃托盤中，然后放入RXZ型(多段編程)智能人工氣候箱(寧波江南儀器廠制造)，在溫度為45°，相對濕度90%的條件下，依次老化0、2、4、 6、 8、10、 12、14 d，按時從智能氣候箱中取出，老化后的種子處理后分類備用。

(2)種子消毒。本實驗采用黑糯一號玉米種子，其發芽率在85%以上。將種子先后浸泡在體積分數為70%的乙醇溶液中30 s和5%次氯酸鈉溶液中10 min，再轉入培養皿。

(3)種子培養。每個設備種植2粒種子，每5 d澆水5 mL。在培養皿周圍包裹黑色塑料薄膜，模擬根系的生長環境，避免光照影響根系構型。

(4)根系圖像獲取。每天09:00和16：00采集根系圖像，檢測根系發育情況。

2 根系圖像修補

2.1 圖像預處理

導入圖像序列，并采用灰度化、二值化、中值濾波、高斯濾波、水漫算法等消除因反光和根系與土壤色差等因素造成的圖像噪聲。

2.2 圖像腐蝕

首先根據玉米根系的生理特性提出2條規則：

(1)端點判定規則。一個端點有且僅有一條所屬根。設圖像區域為Ω，P為其中一點，在以P點為中心的區域D中，若周圍存在不超過2個相連的點，則該點為端點，其數學表達式為

(1)

式中n——m中點的個數ep——端點

m——區域D中除P點以外的8個點

(2)分叉點判定規則。根系的分叉點與多條根連接。設圖像區域為Ω，P為其中一點，在以P點為中心的區域D中，若周圍存在多個不相連的點，則該點為分叉點，其數學表達式為

(2)

式中bp——分叉點

基于以上2條規則提出腐蝕算法，步驟如下：

(1)圖像細化

根據ZHANG-SUEN細化算法[34]提取根系主干，其基本規則如下：①循環所有前景像素，見圖3，對符合如下條件的像素P1標記為刪除。

圖3 前景像素圖Fig.3 Foreground pixel image

(3)

式中N(P1)——與P1相鄰的8個像素點中，前景像素數量

S(P1)——P2～P9～P2中出現0、1的累計次數，其中0和1分別表示背景和前景

②滿足如下條件的像素P1被標記。

(4)

循環上述2個步驟，輸出結果即為二值圖像細化后的骨架。

(2)端點提取

利用端點判定規則得到細化后圖像的端點點集M，并為M中的元素M[i]編號，將元素M[i]存入隊列m1，其序號存入隊列b，見圖4。對于每條直線來說，有且僅有2個端點，經過后續處理后，每條線上的點集編號將相同。

圖4 存儲隊列示例Fig.4 Memory queue

(3)圖像映射

創建一個與細化圖像大小相同的空圖像c，然后將b中的元素保存在對應的坐標c中，即c中元素的坐標等于m1的值。

c(a[i])=b[index(m1[i])]

(5)

式中 index——求取隊列索引值的函數

a[i]——圖像c中對應的坐標

(4)圖像腐蝕

腐蝕算法分為4個步驟，循環以下4個步驟直到隊列m1為空：①隊列m1中彈出一個點P， 將細化圖像上該點的值設為0，即ppop(P)=0,其中ppop為像素歸零函數。②判斷c上P點周圍8個像素點(定義為點q)中是否有點q已經被賦值，若被賦值，則q點編號更新為P點編號，即Number(q)=Number(P),其中Number為編號求取函數。③判斷P點是否是端點，若為端點，則必有一點P1與其相連，令c上P1對應位置的值為P點編號，將P1壓入隊列m1。④若P點為分叉點，則P周圍存在點集，將該點集內部的所有點壓入m1中并將編號存入b中，且c上對應位置應賦值為相應編號。

2.3 圖像生長算法

經過腐蝕算法處理后，屬于不同根系片段的點集具有相同的序號。若將根系片段間的間隙理解為殘缺部分，則修復間隙可以形象地描述為間隙的“生長”過程，為使根系片段正確生長，提出3條規則：

(1)內部連續性規則。在數字化處理的過程中，根系片段被分解為離散化的點，但玉米根系的生長具有連續性。因此可采用最小二乘法對根系片段進行擬合，擬合函數為

f(x)=a0+a1x+a2x2+…+akxk

(6)

損失值l為

(7)

為求得符合條件的a值，對等式右邊求ai的偏導數，得到矩陣

(8)

將矩陣化簡得

(9)

令

可得系數矩陣A=(XTX)-1XTY及其擬合曲線。

(2)片段生長規則。因植物根系生長的連續性，在一定長度內，由根系片段擬合而成的曲線其導數差值非常接近，因此同一根段的端點導數僅在較小的范圍內變化。

(3)近鄰生長規則。在以上2條規則的約束下，生長行為總是發生在最近的2個根段之間。

根系圖像生長算法的具體步驟如下：①依據最小二乘法分別求出每個根段2個端點的導數值和該根段平均導數值，作為根段間生長的依據。②若根段間滿足下列條件，則可正確生長：兩根段平均導數差在某范圍[d1,d2]之內;擬連接的兩根段端點的導數差值不大于設定值d3;根據式(7)計算的兩段損失值不超過某值d4;根據根系的發散特性，一個根段只能作為一個根段的生長起點但可作為多個根段的生長終點。③在滿足步驟②的條件下，采用二次多項式插值和五次函數擬合的方式完成根段間的生長。

腐蝕生長算法的流程如圖5所示。

圖5 腐蝕生長算法流程圖Fig.5 Flow chart of corrosion growth algorithm

3 根系腐蝕生長結果

如圖6a所示，經去噪、灰度化和水漫算法處理的圖像中有很多明顯的斷裂層，且不同根段的長度、寬度等差異明顯。經二值化處理后，可獲得土壤與根系之間的界限，如圖6b所示。為分析根段的特性，利用細化算法得到根系主干圖，根段被抽象為單像素的點，如圖6c所示。在圖6d中，提取根系的所有端點作為腐蝕算法的起點。經腐蝕處理后，不同根段的點集具有唯一編號，且顏色相同，如圖6e所示。最后，基于根系生長規則修復斷根，可得到完整的根系圖像，如圖6f所示。

圖6 腐蝕生長算法結果Fig.6 Diagram of corrosion growth algorithm result

種子早期根系生長狀況是評價種子活力的一種有效方法。本文以根系數目(RTN)、根系長度(RTL)、根系寬度(RTW)、根系延展長度(REL)、根系彎折角(REA)5個生理參數作為評價種子活力指標的基本參數，并通過比例尺計算以上生理參數：利用設備的實際邊框長度(人工測定)和圖上對應像素的個數得出比例尺：1(像素)：0.225(mm)。各參數計算方法如下：

(1)根系數目(RTN)。本文所提出的腐蝕生長算法將同一條根上的像素賦予同一編號，而屬于不同根的像素編號不同，因此序號數目即為RTN，計算公式為

NRT=sum(I)

(10)

式中NRT——根系數目

sum()——返回數組中根系數目的函數

I——用于存儲編號的數組

(2)根系長度(RTL)。經本文算法處理后的圖像為單像素連接的根系骨架圖像，基于該圖像可得到構成根系骨架的像素點數目，經比例尺換算得到RTL，計算公式為

LRT=Rpixel_sum(P)

(11)

式中 pixel_sum()——返回圖像中非黑色像素個數的函數

P——傳入圖像

R——比例尺，像素/mm

(3)根系寬度(RTW)。基于根系的骨架圖像，在原圖直接轉化得到的二值圖像中的每條根上隨機取3個部位，計算其寬度方向上的像素點平均值，并換算為該根系的寬度。再計算所有根系寬度的平均值得到RTW，計算公式為

(12)

式中WRT——根系寬度

avg()——平均值函數

w——根上隨機某部分的寬度，mm

(4)根系延展長度(REL)。即根系系統的寬度，找到骨架圖像上最左側的像素和最右側的像素，計算其橫向距離并換算，即可得到REL，計算公式為

LRE=length(p1,p2)R

(13)

式中LRE——根系延展長度

length()——求兩個像素點之間的水平像素點個數的函數

p1——圖像最左側像素點

p2——圖像最右側像素點

(5)根系彎折角(REA)。即根系分叉點分叉角度的平均值。本文提出的腐蝕生長算法將每條根系擬合成五次函數，通過計算2個擬合函數在分叉點的切線夾角得到一個分叉點的彎折角，再計算所有分叉點的夾角平均值得到REA，計算公式為

(14)

式中ARE——根系彎折角度

angle()——求兩條直線夾角的函數

li——分叉點處擬合的一條切線

lj——分叉點處擬合的另一條切線

4 玉米種子靜態表型參數分析

因種子活力與老化時間呈負相關[35]，且不同活力玉米種子其根系生長狀態差異顯著[36]，因此采用老化時間分別為0、3、7 d的種子來研究不同活力玉米種子的根系表型參數[37]。基于本文所提的腐蝕生長算法進行玉米根系圖像中的斷根修復，測得3種老化時間的玉米種子在土壤中根系發育生理參數如表1～3所示。由表可知，玉米種子活力和根系表型之間具有顯著的相關性。為對所提出的腐蝕生長算法進行評價，將該算法處理得到的根系表型參數測量值與實際值(通過人工方法修復圖像根系并測量得到的數值)進行對比，兩者之間的誤差小于5%。其中，由于土壤遮擋，部分根系不可見，RTL的誤差最大。如圖7所示，未老化的玉米種子和老化14 d的玉米種子，RTN、RTL、RTW和REL分別從14.80條、83.50 mm、1.53 mm和82.70 mm降低到4.38條、36.90 mm、1.38 mm和54.6 mm。通過數據對比分析，發現種子活力與RTN、RTL、RTW、REL呈明顯負相關，且RTL、REL與玉米種子老化程度的關系曲線和種子活力、發芽率與老化程度之間[38]的關系曲線較為相似，而REA與玉米種子活力相關性較小。

表1 未老化根系第7天數據Tab.1 Data records on day 7 of unaged roots

表2 老化3 d根系數據Tab.2 Root data records of three days of aging

表3 老化7 d根系數據Tab.3 Root data records of seven days of aging

圖7 玉米根系靜態參數分析Fig.7 Analysis of static parameters of maize roots

5 玉米種子動態表型參數分析

為研究不同活力的種子其早期根系發育速度的差異，對種子根系參數進行求導處理，如圖8所示，RTN、RTL、RTW、REL與老化程度之間的差異更加顯著。在生長2～12 d的時間里，RTN、RTL、RTW、REL的差值從1.4條、4.2 mm、0.2 mm、0.3 mm變為14.1條、54 mm、0.5 mm、5.4 mm。以上4個生理參數的增速從1.68條/d、8.80 mm/d、0.06 mm/d、9.0 mm/d變為0.70條/d、4.3 mm/d、0.05 mm/d、5.70 mm/d。可見，上述4種根系表型參數的動態變化情況與玉米種子活力之間存在顯著的相關性。

6 結論

(1)為實現玉米根系的高通量原位無損檢測，采用長方體透明容器作為脅迫生長裝置，使絕大部分玉米根系貼壁生長。為得到完整根系，提出腐蝕生長算法用于修復殘缺圖像：經預處理后的圖像消除了因反光和土壤色差造成的噪聲，在細化圖像的基礎上用腐蝕算法處理圖像，將屬于不同根段的點分類存儲，再通過生長算法修復圖像中根系的斷裂部分。本算法適用于須根系植物，可修復根系圖像中的大段斷裂，魯棒性較強。

圖8 玉米根系動態參數分析Fig.8 Analysis of dynamic parameters of maize root system

(2)基于本文提出的根系圖像修復算法，對不同活力的玉米種子進行根系表型研究，結果表明，RTN、RTL、RTW、REL 4個生理參數與種子活力呈現明顯負相關，其變化速率與種子活力之間呈現明顯正相關。