結(jié)核分枝桿菌LysA蛋白抑制劑篩選模型的建立

林 源，崔燁挺，馬雪磊，馬存玲，張 煒，楊延輝

（寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004）

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是危害全球人類健康的重大傳染病之一。T B 的病原體是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）。據(jù)WHO報道，在 2017年，全球有大約1010萬TB新發(fā)病例，130萬人死于TB。近年來，結(jié)核耐藥性問題日趨嚴重，福平耐藥患者和耐多藥結(jié)核病患者數(shù)量逐年增多，耐藥MTB導(dǎo)致現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物治療失效[1]，尋找結(jié)核藥物新靶標和開發(fā)全新結(jié)構(gòu)的抗TB藥物成為當務(wù)之急。針對MTB的生存必需基因開發(fā)新型藥物先導(dǎo)化合物是目前研發(fā)抗TB藥物的重點[2-3]。LysA是MTB賴氨酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，可催化內(nèi)消旋二氨基庚二酸（meso-diaminopimelate，DAP）合成為L-賴氨酸[4-5]。L-賴氨酸對MTB的生長發(fā)育是必不可少的，所以篩選靶向LysA的抑制劑有望成為新的TB藥物[6-7]。我們的實驗將針對原核表達的有酶活性的LysA進行虛擬篩選，獲得潛在的新型抗結(jié)核藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 酶標儀購于美國Bio-TEK公司。

1.1.2 試劑 LysA為本實驗室經(jīng)原核表達并純化。

1.2 方法

1.2.1 茚三酮法測定LysA的活性 虛擬篩選前驗證LysA的活性，LysA在酸性環(huán)境下催化DAP轉(zhuǎn)化為L-賴氨酸，L-賴氨酸與水合茚三酮共熱時生成藍紫色的二酮茚胺，在570 nm有最大吸收峰。測定的吸光度與L-賴氨酸濃度成正比，并由此推算出LysA的酶活性；為排除底物對活性測定的影響，設(shè)置一組不加底物；為排除酶自身及溶液中鹽離子對茚三酮的影響，設(shè)置一組不加酶；為排除其他雜蛋白對活性測定的影響，取與樣品組相同量的酶100 ℃、10 min做滅活處理。

1.2.2 虛擬篩選

使用MOE軟件，將MTB的LysA酶晶體結(jié)構(gòu)1hkv中賴氨酸結(jié)合位點的活性口袋區(qū)域作為受體的對接區(qū)，對1286個已經(jīng)上市的藥物小分子為基礎(chǔ)進行篩選，選取對接分數(shù)最高的前4個分子，以酶活測定體系為基礎(chǔ)評價抑制率。

2 結(jié) 果

2.1 酶活性測定

將酶標儀在570 nm處測定的吸光度（2.707）與氨基酸測定標準曲線進行比對，生成的含氮量為76.37 μg，經(jīng)轉(zhuǎn)化計算純化提取得到的酶活力為503.38 U/10 μL。無底物組、無酶組和酶失活組、空白對照組無顏色變化，在570 nm處的吸光值近于零，因此排除雜蛋白干擾。

2.2 虛擬篩選與抑制劑的確定

通過與MTB LysA晶體的賴氨酸結(jié)合位點（圖1）進行分子虛擬對接，從成藥庫中篩選得到了4個對接打分顯著優(yōu)于賴氨酸本身的已有藥物，分別是nadide、acarbose、sennoside A和lanatoside C，經(jīng)評價acarbose對LysA的酶抑制率最高，可達64.3%（表1）。

3 討 論

MTB的賴氨酸生物合成途徑是從L-天冬氨酸開始經(jīng)歷9步酶促反應(yīng)最終合成L-賴氨酸，最后一步是由LysA /DAPDC催化發(fā)生脫羧反應(yīng)，將底物DAP合成為L-賴氨酸。Dahl，Christiane等人已經(jīng)純化得到了此酶，但并未測定其生物學(xué)活性，本課題在其基礎(chǔ)上測定LysA的活性，為抗結(jié)核藥物的篩選奠定基礎(chǔ)。

LysA由MTB的Rv1293基因編碼，是MTB L-賴氨酸合成所需要的關(guān)鍵酶。靶向結(jié)合LysA的化合物可能干擾細菌L-賴氨酸合成，繼而抑制細菌的生長繁殖[8]。我們用MOE軟件虛擬篩選得到了4個LysA的抑制劑，其中acarbose對LysA的酶抑制率最高，可達64.3%。

表1 虛擬對接打分與酶抑制率

Acarbose（阿卡波糖）是臨床上常用的降血糖藥物，可以與其他降血糖藥或胰島素聯(lián)合應(yīng)用于糖尿病的治療。我們經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)了Acarbose對LysA也具有一定的抑制作用，理論上也具有抗結(jié)核分枝桿菌的作用，可作為抗結(jié)核候選藥物進一步進行研究。