不同毒株犬瘟熱病毒結構基因的通用擴增及序列測定

卜研，史一珺，薛向紅※，趙傳芳，陳杰，廉士珍，朱言柱，胡博

（1.中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112；2.煙臺市動物疫病預防與控制中心，山東 煙臺 264003）

犬瘟熱（canine distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）感染犬、狐、貉和水貂等多種肉食動物而引起的一種急性熱性、高度接觸性傳染病[1]。該病發病率高，臨床癥狀多樣，感染后期容易繼發混合感染，死亡率高達30%～100%。近年來，CDV自然感染宿主不斷增多。隨著人類對犬、貓等寵物擁有數量的增多，犬瘟熱病毒在給動物養殖業、生物多樣化帶來極大損失和危害的同時，還威脅著社會公共安全[2-3]。

CDV是副黏病毒科麻疹病毒屬成員，其基因組為單股負鏈不分節段RNA。從基因組3'到5'端依次為3'端前導序列、核蛋白（N）基因、磷蛋白（P）基因、基質蛋白（M）基因、融合蛋白（F）基因、血凝素蛋白（H）基因、聚合酶蛋白（F）基因和5'尾隨序列[4-5]。其中，H基因是變異率最高的，是CDV 野毒株分子流行病學調查的主要靶基因[6]?；贖基因的多樣性，CDV可分為Asia 1、Asia 2、Europe、European wildlife、America-2、Arctic和America-1 型（又稱疫苗型）。不同基因型犬瘟熱病毒均屬于一個血清型。我國流行毒株主要是Asia 1，但不同犬瘟熱病毒野毒對不同種屬易感動物致病性差別較大，核苷酸序列存在較大差異，且同CDV-3、Lederle、Onderstepoort 等疫苗株的核苷酸序列同源率較低，為89%～90%。由于犬瘟熱病毒野毒株難以適應Vero 細胞，且經過細胞傳代后，存在毒力降低或丟失[7]。因此，學者們構建了穩定表達犬瘟熱病毒受體-信號淋巴細胞激活因子（signalling lymphocyte activation molecule，SLAM）的Vero-SLAM細胞，大大提高了犬瘟熱病毒野毒的分離效率，因此成為目前分離犬瘟熱病毒的首選細胞[8-9]。但犬瘟熱病毒野毒分離株在Vero-SLAM細胞上連續傳代之后是否會發生毒力下降尚無報道。因此，為了快速、精準獲得CDV 結構基因序列，及時準確地追溯犬瘟熱發病病源和開展CDV 遺傳進化分析，本研究設計6 對特異性通用引物，分別對應CDV 毒株的6 個結構基因區域，能夠同時擴增CDV野毒和疫苗毒株，預測能夠實現未知CDV結構基因的有效擴增。該擴增體系的建立，還有助于明確CDV 野毒分離株適應細胞前后，其結構基因核苷酸水平和氨基酸水平變異情況，為人們探究CDV 致病機制、尋找關鍵毒力位點提供基礎，同時，也有望為核酸疫苗和亞單位疫苗研制，及反向遺傳學系統建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 犬瘟熱病毒野毒HBF-1 株、SD14（7）株，犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3株、OR12株、CDV/R-20/8株，均由中國農業科學院特產研究所疫病防控研究室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 GeneAmp PCR System 2700、Nanodrop 2000（ThermoFisher）；RNeasy Mini Kit（Qiagen）；SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis Super-Mix（Invitrogen）；質粒小量提取試劑盒（Axygen）；2 TransStart?FastPfuPCRSuperMix（Transgen）；DNAMarker 15 000、DNA Marker 2 000（TaKaRa）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank 中公布的23 個犬瘟熱病毒全基因組序列，具體毒株和GenBank 號如下：01-2689（AY649446）、007Lm/B（AB490680）、Onderstepoort（AF378705）、CDV SY（KJ466106）、LN（10）1（KP765764）、98-2654（AY466011）、00-2601（AY443350）、SD（14）7（KP765763）、HLJ1-06（JX681125）、98-2646（AY542312）、98-2645（AY445077）、CDV2784-2013（KF914669）、A75 17（AF164967）、Hebei（KC427278）、CDV-3（EU726268）、M25CR/H（AB490681）、50CBI/H（AB490678）、011C/H（AB490674）、PS（JN896331）、Snyder Hill（GU138403）、164071（EU716337）、CDVRD-JL（KJ848781）、CDV-ZC（KJ994343）。對上述所有毒株的各個結構基因序列進行比對分析，利用軟件Primer Premier 5.0 共設計6 對特異性通用引物（序列見表1），用于不同毒株犬瘟熱病毒各個結構基因的擴增和序列測定，預期6 個目的條帶大小分別為1 620、1 614、1 048、2 009、1 894、6 600 bp。

1.2.2 不同毒株犬瘟熱病毒RNA提取 根據RNeasy Mini Kit 操作說明，對不同毒株犬瘟熱病毒的總RNA進行提取。具體操作如下：取犬瘟熱病毒Vero 細胞培養液200μL，加入350μL RLT 使其充分裂解。之后加入等體積的70%乙醇，吹打混勻。取700μL加入到RN-easy spin column 中，置于 2 mL 收集管中，10 000 r/min 離心 15 s，棄流出液。700 μL Buffer RW1 到 RNeasy spin column 中，10000r/min離心15s，棄流出液。500μL Buffer RPE 到 RNeasy spin column 中，10 000 r/min 離心 15 s，棄流出液。500 μL Buffer RPE 到 RNeasy spin column中，10 000 r/min 離心 15 s，將 RNeasy spin column 置于新的2 mL 收集管中，全速離心1 min。將RNeasy spin column 置于新的1.5 mL 收集管中，在濾膜中間加入40 μL RNase free water 10 000 r/min 離心 1 min，洗脫獲得病毒細胞懸液的總RNA。

表1 犬瘟熱病毒6 個結構基因擴增用通用引物序列Table 1 Universal primer sequences for amplification of six structural genes of CDV

1.2.3 不同毒株犬瘟熱病毒cDNA合成 利用Super-ScriptⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix試劑盒反轉錄合成cDNA。以“1.2.2”中獲得的總RNA為模板5μL，50 mmol/L Oligo（dT）1 μL，50 ng/μL Random Hexamers 1μL，Annealing Buffer 1μL，混勻之后在 65 ℃孵育5 min，立即放冰上1 min。之后加入2 First-Strand Reaction Mix 10 μL 和 SuperscriptⅢ RNaseOut Enzyme Mix 2μL 吹打混勻，短離心，在50 ℃孵育50 min。

1.2.4 不同毒株犬瘟熱病毒各個結構基因擴增 根據普通 PCR 試劑盒 2 TransStart?FastPfu PCR SuperMix的說明操作，進行PCR 擴增。PCR 反應總體系50 μL包含以下組分：2 TransStart?FastPfu PCR SuperMix 25μL，上游引物 1μL，下游引物1μL，病毒cDNA2μL，ddH2O補齊至 50 μL。設定 PCR 程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，實際退火溫度（參照表1 中預先摸索好的不同引物對的退火溫度）20 s，72 ℃ 30 s，40 個循環；72 ℃ 7 min。取不同毒株犬瘟熱病毒的N、P、M、F、H 和L 基因的PCR產物5μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，判斷條帶大小，同時驗證引物的特異性、通用性。

1.2.5 犬瘟熱病毒結構基因序列測定 將野毒HBF-1株和疫苗毒CDV-3 株的6 個PCR 擴增片段進行凝膠回收后，所有片段連接至平端載體pEASY-Blunt，利用雙酶切鑒定出正確的重組子，送上海生工進行片段序列測定，最后利用SeqMan進行全長拼接。將HBF-1 株的各個結構基因序列與GenBank 公布的Hebei 株序列進行同源性比對；將CDV-3 株的各個結構基因序列與GenBank 公布的CDV-3 株序列進行同源性比對。

1.2.6 各個基因擴增用引物對的特異性 為了明確各個基因擴增用的引物對是否只能針對犬瘟熱病毒擴增，對其他種類的犬源病毒（如犬細小病毒和犬II 型腺病毒）能否實現擴增，以犬細小病毒和犬II 型腺病毒DNA 為模板，用之前摸索好的相同條件進行PCR擴增。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結果與分析

2.1 犬瘟熱病毒各個結構基因的PCR擴增結果

利用特異性通用引物（表1），對犬瘟熱病毒野毒HBF-1 株、SD14（7）株和犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3 株、OR12 株、CDV/R-20/8 株的 cDNA 進行擴增。取 5 μL擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，篩選的6 對特異性通用引物能夠實現對不同毒株的N、P、M、F、H 和L 基因特異性擴增，而且獲得目的條帶大小，與預期一致（圖1～6）。

圖1 犬瘟熱病毒不同毒株N 基因的擴增結果Fig.1 Amplification of N gene for different strains of CDV

圖2 犬瘟熱病毒不同毒株P 基因的擴增結果Fig.2 Amplification of P gene for different strains of CDV

圖3 犬瘟熱病毒不同毒株M 基因的擴增結果Fig.3 Amplification of M gene for different strains of CDV

圖4 犬瘟熱病毒不同毒株F 基因的擴增結果Fig.4 Amplification of F gene for different strains of CDV

圖5 犬瘟熱病毒不同毒株H 基因的擴增結果Fig.5 Amplification of H gene for different strains of CDV

圖6 犬瘟熱病毒不同毒株L 基因的擴增結果Fig.6 Amplification of L gene for different strains of CDV

2.2 犬瘟熱病毒野毒HBF-1株各個結構基因的序列測定

對犬瘟熱病毒野毒 HBF-1 株擴增獲得的6 個結構基因片段，瓊脂糖凝膠電泳后，進行膠回收純化。將片段連接至平端載體pEASY-Blunt 上，挑取陽性克隆子送上海生工進行序列測定，每個堿基至少測序6 次以上，確保序列的準確性。HBF-1 的各個結構基因序列與2012 年 GenBank 公布的 Hebei 株的對應的結構基因序列進行比對，由于HBF-1 是Hebei株在Vero-SLAM細胞上的適應株，因此兩者的同源率高達99.8%～100%。此外，CDV 核苷酸序列具有高變性[10]。本研究設計的6 對引物，能針對犬瘟熱病毒野毒株HBF-1 的各個結構基因進行準確擴增，獲得6 個結構基因的準確序列。

2.3 犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3株各個結構基因的序列測定

對CDV-3 株病毒擴增獲得的6 個結構基因片段，瓊脂糖凝膠電泳后，進行膠回收純化。將片段連接至平端載體pEASY-Blunt 上，挑取陽性克隆子送上海生工進行序列測定，每個堿基至少測序6 次以上，確保序列的準確性。最后，獲得CDV-3 株的全基因組序列。與2012 年GenBank 公布的CDV-3 株各結構基因序列進行比對，發現同源率高達99.3%。證實，本研究設計的6 對引物，能針對犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3 株的6 個結構基因進行準確擴增，獲得其準確序列。

2.4 各個基因擴增用引物對的特異性

以犬細小病毒和犬II 型腺病毒DNA 為模板，用之前摸索好的相同條件進行PCR 擴增。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖7 所示。圖1～6 與圖7，互為陰陽性對照。

圖7 6對引物對犬細小病毒和犬II型腺病毒基因組的擴增結果Fig.7 Genome amplification of canine parvovirus and canine adenovirus type II by six pairs of primers

3 討論

近年來，犬瘟熱病毒自然感染宿主擴大，多種野生動物，甚至珍稀野生動物有報道感染CDV 而發病、死亡[11]。學者們利用細胞傳代適應法獲得了多株犬瘟熱病毒分離株，但是犬瘟熱病毒分離株在Vero 或Vero-SLAM細胞上連續傳代之后是否會發生毒力位點的突變，這些突變是否會影響病毒毒力下降尚無明確報道。因此，準確獲得犬瘟熱病毒野毒株的6 個結構基因序列，對尋找關鍵毒力位點至關重要。另外，及時準確地獲取不同毒株（甚至未知毒株）犬瘟熱病毒結構基因序列，有利于分析犬瘟熱病毒遺傳進化規律，追溯犬瘟熱病毒的可能來源。同時，可為核酸疫苗、亞單位疫苗和反向遺傳平臺的建立奠定基礎。

目前，針對犬瘟熱病毒各個結構蛋白的基因擴增有一些報道[12-13]，均是針對一種毒株的。犬瘟熱病毒可以感染很多宿主，實現跨種屬感染與傳播，犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株基因序列變異率較大，尤其是H 和F 基因序列。因此，為了提高科研效率、節省科研時間和避免資源浪費，本研究設計并篩選出6 對特異性通用引物，一次性精確地實現了犬瘟熱病毒野毒和疫苗毒株6 個結構蛋白基因的通用擴增，對犬細小病毒和犬腺病毒均無擴增，證明了6 對引物的通用性和特異性。擴增過程中，可能因為病原模板量的不同，存在擴增亮度的稍微差異，可以通過增加擴增體系，實現大量擴增。HBF-1 是狐源犬瘟熱病毒野毒分離株[14]，OR12是犬瘟熱病毒貉體適應株，可見，本研究設計的6 對通用引物能夠實現不同宿主來源的犬瘟熱病毒結構蛋白基因的有效擴增。這大大提高了獲得不同毒株犬瘟熱病毒結構基因序列的效率，縮短了獲得其他犬瘟熱病毒未知毒株結構基因序列的時間。這有助于我們明確犬瘟熱野毒適應細胞前后病毒各個結構蛋白核苷酸序列變異情況，追溯CDV 變異來源和規律，有助于人類認識犬瘟熱病毒野毒的致病機制，為尋找犬瘟熱病毒野毒關鍵毒力位點提供分子依據。同時，6 對引物的通用擴增，為CDV結構基因的重組構建和反向遺傳平臺中輔助質粒的構建提供了便利。