鹿科動物染色體研究進展

唐麗昕，張然然，董世武，邢秀梅

（中國農業科學院特產研究所特種經濟動物分子生物學重點實驗室，吉林 長春 130112）

我國鹿類資源豐富，共有21 種，占全球的41.7%[1]。其中，鹿科動物屬于哺乳綱偶蹄目，因其是名貴的藥用動物而具有很高的研究價值。

染色體是細胞核內主要遺傳物質的載體，它可以儲存和運輸DNA。染色體的變異包括染色體數目和結構的變異。染色體數目變異，指染色體整倍性和非整倍性變異。染色體結構變異則包括染色體片段的重復、缺失、倒位以及易位[2]。而染色體任何數目和結構上的變化都可能引起物種遺傳變異的發生。染色體的這種變異也是生物多樣性的主要來源之一。染色體研究無論對于了解物種的進化起源問題，還是研究新物種的形成，都有重要的意義[3]。對染色體的研究方法包括核型、帶型分析以及結合微陣列分析[4]，熒光原位雜交[5]技術等。而鹿科動物已有的染色體研究普遍是核型和帶型的。本文擬對近些年來鹿科動物染色體的相關研究方法以及研究進展進行概述。

1 鹿科動物染色體核型研究

核型又稱染色體組型，是染色體形態學上的概念，指染色體的形態特征、大小及數目的總和。每種生物都有其特定的一套染色體核型。一般情況下，一個體細胞的染色體核型就可以代表個體的染色體特征。對物種染色體核型的觀察可以得到染色體的基本形態學特征。同時，通過對物種間染色體核型的觀察與比較，可以觀察出物種在染色體核型上的特異性[6]。染色體核型的研究為進一步的分子細胞生物學研究奠定了基礎。

鹿科動物的進化起源問題一直都存在著一些爭議，尤其是梅花鹿和馬鹿之間進化起源的先后問題。針對這一問題，僅從物種性狀特征的進化以及地理分布變化方面進行研究是遠遠不夠的。染色體核型的研究對于解決物種分類及進化起源問題是十分有必要的。一方面，可以從染色體數目和結構發生的差異來探尋鹿科動物染色體發生變異的主要機制；另一方面，可以從細胞遺傳學角度為鹿科動物的分類及進化起源問題的后續研究提供一定的理論依據和參考。

在國外，很早就有學者對一些鹿科動物的染色體核型做過相關研究。自20 世紀60 年代開始，國內外就有鹿科動物染色體相關的研究報道。1963 年，Benirschke等[7]報道了弗吉尼亞白尾鹿的二倍體染色體數目為70。Gustavsson 等[8]報道了5 種鹿科動物的二倍體染色體數目，駝鹿（Alces alces）為 68，狍（Capreolus capreolus）為 70，馬鹿（Cervus elaphus）為 68，梅花鹿（Cervus nippon）為 67，黇鹿（Dama dama）為 68。

1.1 梅花鹿染色體核型研究

梅花鹿是國家一級保護動物，已被列入《中國瀕危動物紅皮書》，很多學者都對其染色體的核型進行了研究。國外學者Gustavsson 等[9-10]報道了東北梅花鹿染色體數2n=64，68；日本梅花鹿染色體數目2n=66，67。而國內俞秀璋等[11]、王宗仁等[12]均通過試驗得出東北梅花鹿染色體存在多態性2n=64 68。王宗仁等[13-14]報道，日本梅花鹿染色體數目的多態性2n=66 68。同時，通過將東北梅花鹿、東北馬鹿和中亞馬鹿的染色體核型作比較分析得出，雖然中亞馬鹿是馬鹿的一個亞種，但其與東北馬鹿的染色體數目有差異，而與東北梅花鹿的相似，很可能是因為中亞馬鹿較其他馬鹿在進化上起源較早、比較接近于梅花鹿。祁得林[15]對青海地區梅花鹿染色體核型的研究證明，梅花鹿的染色體數2n=64 66，68，存在多態現象。梅花鹿染色體的多態現象，不僅存在于亞種之間，還存在于同一亞種的不同個體間，而這種多態現象可能與不同類型染色體數目的差異有關。

1.2 馬鹿染色體核型研究

馬鹿是大型鹿科動物，因其體型大、產茸量高而具有較大的研究價值。我國馬鹿主要分布在西北，新疆地區，東北地區也有分布。王宗仁等[12,14]分別研究了中亞馬鹿和東北馬鹿的染色體核型，中亞馬鹿的染色體數目為2n=66、67，存在多態現象，而東北馬鹿染色體數目2n=68，并不存在多態現象。王宗仁等[13]也得出青鹿、東北馬鹿染色體數目為2n=68，青鹿和東北馬鹿的染色體組型一致，這就為將這2 個馬鹿亞種并為1 個亞種提供了依據。另外，李軍祥等[16]對青海地區的馬鹿染色體核型進行了分析，得出染色體數2n=68。馬鹿染色體存在多態性可能是因為減數分裂過程中配子隨機結合。

1.3 駝鹿染色體核型研究

國外對駝鹿的研究比較早，Aula 等[17]在1964 年首次對歐洲駝鹿（A.a.alces）進行了核型研究，得到歐洲駝鹿染色體數是2n=68。隨后，Hsu等[18]對西氏駝鹿（A.a.shirasi）和北美東部駝鹿（A.a.americana）進行了核型研究，得到這2 個亞種的染色體數是2n=70。而國內，卜令浩[19]對遠東駝鹿的染色體核型進行了觀察，其染色體數目是2n=68。將這3 個駝鹿亞種染色體核型的研究結果進行綜合分析，得出遠東馬鹿與歐洲馬鹿因核型相似而在親緣關系上也更近。

1.4 其他鹿科動物染色體核型研究

還有一些其他鹿科動物的染色體核型研究，Miyake等[20]對蝦夷鹿染色體核型研究發現，其核型不存在多態性。段幸生等[21]研究結果表明，黑麂的染色體數目（雄）2n=9，（雌）2n=8。毛冠鹿是分布在我國南方地區的珍稀鹿種。1983 年，張錫然等[22]首次報道了毛冠鹿的雌性核型（2n=47）和雄性核型（2n=48）。隨后，王宗仁等[23]發現毛冠鹿染色體眾數是2n=46。孔亞慧等[24]則發現毛冠鹿核型存在多態現象，證明了毛冠鹿有4 種核型。粘偉紅等[25]首次發現在毛冠鹿染色體中存在2 條異型的X染色體。王宗仁等[14]將爪哇鹿與云南黑鹿的染色體核型進行比較，發現其染色體的核型、帶型都很相似，確定了爪哇鹿和黑鹿是親緣關系非常近的一個種。

1.5 雜交鹿染色體核型的研究

除了對純種鹿染色體核型的研究外，還有一些對雜交鹿染色體核型的相關研究。方元等[27]研究并報道了云南水鹿和東北梅花鹿雜交鹿（F1）的染色體組型。雜交鹿（F1）的染色體數為2n=64。俞秀璋等[28-29]對赤鹿和梅花鹿的雜交后代進行了核型分析，初步表明其染色體數雌雄均為2n=67，此外，還對東北梅花鹿和東北馬鹿的雜交后代進行了核型研究，發現雜交后代染色體數目為2n=66 68，而且染色體數目為2n=67 的雜交鹿是可育的核型。

1.6 鹿科動物染色體核型進化機制

王宗仁[26]通過將自已與前人的研究結合起來對鹿科動物染色體核型進行比較歸納，總結得出染色體變異的機制：鹿科動物染色體的變異主要是常染色體數目的變化。引起染色體數目發生變化的機制主要是羅伯遜斷裂（即1 條中心著絲粒染色體斷裂，形成2 條端著絲粒染色體）。

2 鹿科動物染色體顯帶技術

對于鹿科動物染色體的研究，常規的核型研究一直是不可忽視的。但是，隨著鹿科動物染色體研究的不斷深入，越來越多的學者嘗試著將一些相對成熟的哺乳動物染色體研究技術應用于鹿科動物染色體的研究中，其中就包括染色體顯帶技術。染色體顯帶技術使染色體的研究更加深入，其不僅可以顯示種內的染色體分化，而且能揭示許多核型研究不能顯示的種間差異[30]。染色體的帶型主要包括 G 帶、C 帶、Q 帶、R 帶以及銀染Ag-NORs（N帶）等。而對鹿科動物染色體帶型的分析，G 帶、C 帶、R 帶以及銀染 Ag-NORs 的研究效果比較理想。Q帶在鹿科動物染色體研究的文章并不多見。染色體顯帶技術及對其帶型的分析成為研究鹿科動物細胞遺傳學的又一重要方法。

2.1 G帶

G帶分析是染色體顯帶分析中應用最廣泛的顯帶技術。將制備好的染色體標本用堿、胰蛋白酶或其他鹽溶液處理后，再使用Giemsa 染液染色，在普通顯微鏡下，可見深淺相間的帶紋，稱G 帶（G band）。在G 帶分析中，每條染色體均有其特定的帶型特征，G帶暗紋區富含A-T 堿基對，亮帶區則富含G-C 堿基對，深淺條紋交替排列在染色體上[31]。通過對于G 帶的分析，可以得出染色體具體的類型、數目，以及相關的帶紋特征信息。俞秀璋等[32]通過對東北梅花鹿G帶的觀察得出結論：確認東北梅花鹿染色體數2n=66，個體間染色體數不存在多態現象，但在同一個體內細胞染色體數有差異。王宗仁等[33]對白唇鹿的染色體G 帶觀察發現，白唇鹿在染色體數目及形態上都和東北梅花鹿十分相似且染色體類型相同。

2.2 C帶

C 帶是組成異染色質帶的簡稱。C 帶是用堿性溶液〔飽和Ba（OH）2溶液〕處理制片標本，再使用Giemsa染液染色得到的帶型。染色體的C 帶分析多用于染色體的多態分析，顯示的是染色體全部的結構異染色質區域、次縊痕位置以及 Y 染色體。深染色的區域是DNA重復序列。這種顯帶方法特別適合于染色體的著絲粒區和Y染色體長臂的觀察。段幸生等[21]通過對黑麂 C 帶的研究發現其染色體著絲點區特別長且異染色質非常豐富，但異染色質的短臂長短有異，存在多態現象。粘偉紅等[25]對毛冠鹿C 帶進行研究，發現毛冠鹿異染色質的分布和含量存在差異會導致染色體產生多態現象：常染色體上異染色質分布不均勻使得同源染色體產生差別，而在性染色體上因為異染色質含量不同，染色體大小產生明顯差別。

2.3 R帶

R 帶是G 帶的反帶，在G 帶呈深帶的區域，R 帶呈現的就是淺帶。R帶是用熱鹽處理制片標本，再使用Giemsa 染液染色，得到與G 帶帶型相反的帶紋。R 帶的顯帶技術主要用來研究染色體末端發生的異常，如缺失和重排。而鹿科動物方面，蔣德梅[34]通過試驗得到東北梅花鹿R 帶模式圖，并將其與已有的鹿科動物的染色體R 帶進行比較，發現了在染色體的壓縮層面上，同一物種的相似性和穩定性以及同一物種不同亞種間的差異性。

2.4 N帶

N 帶又稱銀染Ag-NORs 顯帶，是在高溫條件下，用三氯醋酸處理制片標本，再在溫育后用Giemsa染液染色得到的核仁組織區深染，其他部分淺染的帶型。N帶顯帶技術主要用來對結構上的非組蛋白的蛋白質和核仁組織區特異性結合的地方進行識別和分析。Ag-NORs 是隨染色體而遺傳的，可作為品種特征的遺傳標記之一，用于研究品種間的差異，以探討品種的起源進化。在家豬[35-36]上已有報道Ag-NORs，不但有品種和個體差異，而且與豬的起源進化有關。而鹿科動物中，韓莉[37]觀察發現Ag-NORs 主要位于染色體的著絲粒位置，說明東北梅花鹿的異染色質主要以著絲粒帶的形式出現，通過與C 帶比較，說明東北梅花鹿染色體在亞種水平上可能存在異染色質多態性。

2.5 其他

另外，還有一些其他的研究，例如染色體的高分辨顯帶，限制性內切酶顯帶等。高分辨染色體，是指通過某種處理，獲得有絲分裂早期染色體的分裂相，顯帶后可得到更多更細的帶紋，從而提高了人類對染色體的分辨力[38]。趙婉婷等[39]通過試驗得出單套染色體共顯帶456 條，并以此為基礎，繪制了梅花鹿高分辨G 帶模式圖。而限制性內切酶顯帶技術因其可對原位固定的染色體誘導顯帶，并可從光鏡和電鏡多個角度對染色體結構進行分析，被廣泛應用于真核生物中。蔣德梅等[40]采用限制性內切酶Hae Ⅲ和Hind Ⅲ分別處理東北梅花鹿中期染色體標本，得到了類似G 帶和C 帶，同時得出了12 對常染色體和1 對性染色體具有異質性。

3 熒光原位雜交技術在動物染色體研究中的應用

熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，FISH）技術可以鑒別特異性序列，染色體亞區，或整個基因組；可以特別地突出中期或間期細胞的形態和數目。該技術可用于識別染色體，檢測染色體異常或確定特定序列的染色體位置。FISH 在細胞遺傳學、產前診斷、腫瘤生物學、基因擴增和基因定位等諸多研究領域發揮著越來越重要的作用[41]。其原理是將特定的DNA探針用熒光素進行標記，再將標記后的探針與靶DNA進行原位雜交，經熒光檢測體系在鏡下對靶DNA 進行定性、定量或相對定位分析[42]。染色體異常包括染色體數目和結構的異常，而大部分數目的異常都會導致疾病的發生。單單采用染色體顯帶分析并不能解決所有的染色體異常問題，而采用熒光原位雜交技術能很好地解決[43]。丁銀潤[44]采用熒光原位雜交技術直接檢測出昆明山海棠水抽提物（THH）在哺乳動物細胞中作用產生的非整倍體。Bonnet-Garnier A[45]利用熒光原位雜交（FISH）技術，采用牛和山羊的BAC 探針，驗證了13 個通過普通的R 帶顯帶分析得不出的羅伯遜易位。

4 小結與展望

染色體的研究在對了解生物的遺傳變異、系統演化、性別決定、個體發育和生理過程的平衡和控制等方面都有重要作用，染色體分析已經是細胞遺傳學必不可少的重要環節[25]。

鹿科動物種類繁多，且經濟價值較高。對于鹿科動物染色體，最集中的研究時間是20 世紀80～90 年代，主要是在細胞水平上的研究，借助顯微鏡來觀察各鹿科動物及其雜交后代的染色體核型及其不同種類的顯帶分析。細胞遺傳學的核型和顯帶分析已經研究得十分深入。隨著分子生物學技術的發展，針對染色體的研究從細胞遺傳學深入到分子細胞遺傳學。我們對于鹿科動物染色體的研究不能僅僅局限于細胞水平上核型以及顯帶分析，應該在此基礎上拓展新的、更具意義的研究領域。可以把基本的染色體核型研究與現代先進的生物技術以及生物信息學相結合，將染色體進行深度剖析，逐步獲得基因在染色體上的定位，一方面，將不同鹿科動物同一位置染色體上的序列進行比對，從而解釋鹿科動物中不同物種，甚至亞種間的差異。另一方面，將細胞遺傳學研究轉向基因組學研究，從基因組學的水平上研究鹿科動物染色體與基因以及基因對應的生物重要性狀的關系，將鹿科動物染色體的研究帶入到一個全新的基因組學時代。