磁性固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定環境水樣中12種喹諾酮類抗生素殘留

魏 丹，國 明，吳慧珍，陶星名

(1．杭州萬向職業技術學院 健康與現代農業系,杭州310023; 2．浙江省化工研究院 分析測試中心,杭州310023;3．浙江樹人大學 生物與環境工程學院,杭州310023)

喹喏酮類抗生素是在母核4-喹酮相應位置引入不同基團進行人工合成的一種抗生素。喹喏酮類藥物具有廣譜、耐藥性低、不良反應少、使用方便、價格便宜等優點,被廣泛應用于臨床、畜牧和水產等領域,但是由于長期對喹諾酮抗生素的不合理使用和排放,造成了該類抗生素對土壤及其周圍地表水的污染。這種抗生素不僅會抑制環境中有益微生物的活性,刺激病原菌產生抗藥性,對陸生或水生生態系統產生負面效應,還會通過飲用水、食物鏈等方式進入人體進而影響人體健康。由于水體中該類抗生素的種類繁多且含量較低(多以ng·L－1級的低質量濃度存在[1])。因此,建立該類抗生素殘留的快速靈敏的檢測方法十分重要。

目前,喹諾酮類抗生素殘留的測定方法主要有微生物法、免疫檢測法[2]、高效液相色譜法[3-5]、液相色譜-質譜法、高效液相色譜-質譜法、超高效液相色譜-串聯質譜法[6]和高效毛細管電泳法等。其中,液相色譜-質譜法具有靈敏高效、快速準確和專屬性強等優勢,在喹諾酮類藥物殘留分析領域得到廣泛應用[7]。磁固相萃取(MSPE)是一種以磁性材料為吸附劑的固相萃取(SPE)技術,與傳統的固相萃取方法相比,該方法更簡便、快速、經濟,其在分析檢測的領域具有很好的應用前景。

本工作用零價納米鐵(nZVI)和氧化石墨烯(GO)制備了GO＠n ZVI磁性材料,這種復合材料中具有大π共軛體系、比表面積較大、在水溶液中的分散性良好等特點,可以和喹諾酮藥物分子形成π-π共軛結構,對喹諾酮類抗生素具有較大的吸附容量和良好的回收率。本工作先用磁性材料對目標物進行固相萃取,然后再進行高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)測定,以期為該類抗生素的檢測提供技術支持和參考。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1290 infinity型高效液相色譜儀;6460 Triple Quad 型質譜儀;Milli-Q 型超純水器;KQ-100DE型超聲波清洗器;Seven Easy S30型p H 計。

GO 儲備溶液:在1．0 g GO 中加1 L的水,超聲分散15 min,加水配制成1 000 mg·L－1的 GO 儲備溶液,常溫保存。

12種喹諾酮抗生素標準儲備溶液:分別稱取0．100 0 g的沙拉沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、培氟沙星、環丙沙星、依諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星、吡呱酸、西諾沙星、噁喹酸、萘啶酸于100 m L容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得到1 000 mg·L－1標準儲備溶液,于4 ℃冰箱內避光保存。使用時,以含有0．2%(體積分數,下同)甲酸的20%(體積分數,下同)甲醇溶液稀釋至所需濃度。

依諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環丙沙星、洛美沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、噁喹酸、吡呱酸、萘啶酸和西諾沙星等喹諾酮抗生素標準品的純度為99．0%;甲醇、乙腈均為色譜純;二氯甲烷,乙酸,氨水,乙酸銨等為分析;nZVI 的純度大于99．5%;GO 的純度大于99%;試驗用水為超純水(電阻率不小于18．2 MΩ·cm)。

1．2 儀器工作條件

1)色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(3．0 mm×100 mm,1．8μm),柱溫35 ℃;流量0．3 m L·min－1;進樣量10μL;流動相為甲醇(A)和1%(體積分數)甲酸溶液(B);梯度洗脫程序:0～1 min時,A 為10%;1～7 min時,A 由10%升至40%;7～10 min 時,A 由40%升至60%;10～11 min時,A 由60%升至90%;11～12 min時,A由90%降至10%,保持3 min。

2)質譜條件 電噴霧離子源(ESI),采用正離子檢測模式;多反應監測(MRM)模式;干燥氣氮氣,溫度為300 ℃,流量5 L·min－1;霧化氣氮氣,壓力310 k Pa;鞘氣為氮氣,溫度250 ℃,流量10 L·min－1;毛細管電壓3 500 V。

12種喹諾酮的質譜參數見表1。

表1 質譜參數Tab．1 MS parameters

1．3 試驗方法

1．3．1 GO＠nZVI磁性材料的制備

常溫下,將1．0 g的nZVI加入至10 m L 水中,超聲分散15 min。然后再加入50 m L 的GO 儲備溶液,渦旋振蕩30 s,用磁鐵分離下層黑色沉淀物,即得到GO＠nZVI磁性材料。

1．3．2 測定方法

采集的環境水樣經0．22μm 微孔濾膜過濾除去懸浮顆粒物。稱取15 mg的GO＠nZVI磁性材料于10．0 m L燒杯中,依次用甲醇、水清洗和活化后,加入10 m L 水樣,用乙酸和氨水調節酸度至p H 7．0,振蕩5 min,使GO＠nZVI磁性材料對喹諾酮抗生素進行充分吸附;用磁鐵將GO＠nZVI材料分離收集在燒杯底部,棄去上清液。在磁性材料中加入1．0 m L 氨水,超聲10 min 進行洗脫,重復2次,合并洗脫液并吹氮至近干,用100μL 水溶解殘留物,過0．22μm 微孔濾膜,濾液按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2．1 GO＠nZVI磁性材料表征

對GO＠nZVI磁性材料進行了SEM 和FTIR表征,見圖1。

圖1 GO/nZVI的SEM 圖和FTIR 圖Fig．1 SEM image and FTIR spectrum of GO/nZVI

由圖1(a)可以看出:nZVI被GO 片層結構附著,其表面相連團聚在一起,形成蓬松的結構,直徑為100～500 nm,這是由于nZVI與GO 混合后,在靜電相互作用力的驅動下,兩者迅速沉降所致。從圖1(b)可以看出:GO 的特征峰如－COOH(1 725 cm－1)、C－O－C(1 224 cm－1)和C－OH(1 042 cm－1)的特征峰完全消失,GO/nZVI磁性材料的紅外吸收譜線和nZVI的完全重疊,說明GO已緊密附著于nZVI的表面。

2．2 磁性固相萃取條件的優化

吸附和洗脫過程是影響磁性固相萃取效果的關鍵步驟,試驗考察了吸附劑用量(5,10,15,18,20 mg)、吸附時間(1,2,3,5,8,10 min)、洗脫劑種類(甲醇、水、p H 9氨水溶液、p H 11氨水溶液和氨水)和洗脫時間(5,10,15 min)對10 m L 的10．0μg·L－1喹諾酮混合標準溶液的萃取回收率的影響,見圖2。

由圖2(a)可知:12種喹諾酮的萃取回收率隨吸附劑用量的增加而增加,當吸附劑用量大于15 mg時,萃取回收率基本保持穩定?？紤]到吸附劑用量越多越不利于洗脫,試驗選取吸附劑的用量為15 mg。如圖2(b)所示:當吸附時間為5 min 時,12種喹諾酮的萃取回收率較大,繼續增加吸附時間,萃取回收率基本保持不變,試驗選擇的吸附時間為5 min。由圖2(c)可知:和甲醇、水、p H 9的氨水溶液、p H 11的氨水溶液相比,氨水對目標物的萃取回收率較高,試驗選擇氨水作洗脫劑。由圖2(d)可知:萃取回收率隨洗脫時間的延長而增加,當洗脫時間大于10 min時,萃取回收率基本不變。試驗選擇的洗脫時間為10 min。

2．3 磁性材料的可重復利用性

可重復利用性是評價磁性材料的重要指標之一。按照測定方法用磁性材料對喹諾酮抗生素進行磁固相萃取,重復使用10次后,磁性材料對目標物的萃取回收率較第一次的減少約10%,說明GO＠nZVI磁性材料具有良好的可重復利用性。

2．4 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件對12種喹諾酮混合標準溶液進行測定,以各目標物的質量濃度為橫坐標,其對應的色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線,各喹諾酮抗生素的線性范圍均為1～50μg·L－1,線性回歸方程、相關系數見表2。

以3倍信噪比計算檢出限(3S/N),10 倍信噪比計算測定下限(10S/N),結果見表2。

2．5 精密度試驗

按照測定方法對含有5．0,10,20μg·L－1混合標準溶液的空白樣品進行測定,以5次重復測定結果的相對標準偏差(RSD)計算日內精密度,連續5 d測定結果的RSD 計算日間精密度,結果見表3。

添加了20μg·L－1混合標準溶液的空白水樣的色譜圖見圖3。

圖2 12種喹諾酮抗生素在不同條件下的固相萃取回收率的影響Fig．2 Solid phase extraction recovery of the 12 quinolone antibiotics obtained under various conditions

表2 線性參數、檢出限、測定下限和精密度試驗結果Tab．2 Linearity parameters，detection limits，lower limits of determination and results of tests for precision

2．6 回收試驗

按試驗方法對杭州地區3種空白環境水樣(西溪濕地水、自來水和茶園灌溉用水)中的喹諾酮類抗生素的含量進行測定,均未檢出喹諾酮類抗生素殘留。以這3種環境水樣為基底進行3 個濃度水平(5．0,10,20μg·L－1)的加標回收試驗,結果見表4。

表3 精密度試驗結果Tab．3 Results of tests for precision

圖3 空白水樣中混合標準溶液的色譜圖Fig．3 Chromatogram of mixed standard solution added in blank water sample

表4 回收試驗結果Tab．4 Results of test for recovery

本工作建立了磁性固相萃取-HPLC-MS/MS測定環境水樣中12種微量喹諾酮類藥物殘留的方法,與其他文獻報道的方法相比[8-11],該方法具有綠色環保、檢出限低、重現性好等特點,適用于環境水樣中微量喹諾酮類藥物的富集及檢測。