固相萃取-離子色譜法測定血液中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸

趙志東，孟 嬌，張顯強，王曉卉

(1．貴州警察學院 實驗中心,貴陽550005; 2．貴州警察學院 法律系,貴陽550005;3．貴州警察學院 刑技系,貴陽550005)

草甘膦是目前世界上使用量最大的除草劑之一,被廣泛應用于控制農(nóng)田或非耕作用地中一年生或多年生雜草的生長[1]。草甘膦是一種生物蛋白質(zhì)合成抑制劑,其通過抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸鹽合成酶(EPSPs)的活性,使植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻,致使植物死亡[2]。草甘膦原藥在美國毒性分級中被評定為III,被認為是相對較安全的農(nóng)藥,但經(jīng)商品化改造的草甘膦的毒性是前者的數(shù)倍[3],會造成人體上皮細胞膜的損傷[4]、細胞中的血漿損傷和線粒體功能受損[5],甚至有致癌的風險。

目前草甘膦的測定方法主要有分光光度法[6-7]、高效液相色譜熒光法[8-11]、離子色譜法[12-14]、氣相色譜-質(zhì)譜法[15-16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-21]等。檢測對象多為水、農(nóng)產(chǎn)品、蔬菜等,對人血液中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的檢測鮮見報道[12]。本工作用乙腈沉淀蛋白后,通過3個不同的固相萃取柱對血液進行凈化,然后用離子色譜法對其進行了分析,以期滿足對血液中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的檢測需要。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Dionex Aquion型陰陽離子色譜儀,配Dionex AERS-300 4 mm 陰離子抑制器;MS3 basic型渦旋混合器;KQ 500DE 型數(shù)控超聲波清洗器;PUERLAB Ultra ELGA 型純水儀;TGL-16C 型離心機;島津AUW 320型電子天平。

Dionex On GuardⅡ固相萃取柱,包括ionex On GuardⅡRP 柱 (RP 柱,1．0 m L)、Dionex On GuardⅡAg柱(Ag柱,1．0 m L)和Dionex On GuardⅡNa柱(Na柱,1．0 m L)。

混合標準儲備溶液:稱取草甘膦標準品102 mg和氨甲基膦酸標準品101 mg,用水溶解并定容至100．0 m L,得到1．0 g·L－1混合標準儲備溶液,置于4 ℃冰箱中避光保存。

混合標準溶液系列:將混合標準儲備溶液稀釋,配制成10,20,50,100,200,500,1 000,2 000,5 000,10 000μg·L－1混合標準溶液系列。

草甘膦和氨甲基膦酸標準品的純度分別為98%,99%。

乙腈為色譜純,試驗用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

采用Dionex IonPac AS-19 陰離子分析柱(250 mm×4 mm)及 IonPac AG-19 保 護 柱(50 mm×4 mm);抑制電流165 m A,流量1 m L·min－1;定量環(huán)25μL;柱箱溫度30 ℃,電導檢測池溫度35 ℃;采用不同濃度的氫氧化鉀溶液進行淋洗,梯度淋洗程序:0～5 min 時,氫氧化鉀濃度為10 mmol·L－1;5～13 min 時,氫氧化鉀濃度為10～65 mmol·L－1;13～20 min時,氫氧化鉀濃度為65 mmol·L－1;20～25min時,氫氧化鉀濃度為10 mmol·L－1。

1．3 試驗方法

用移液器移取1 m L 血液樣品,置于15 m L 塑料離心管中,分別加入5,100,1 000 mg·L－1混合標準溶液100μL,再加入2 m L乙腈,用于沉淀蛋白質(zhì),最后加入水6．9 m L,振蕩5 min,以7 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液分別過經(jīng)活化的RP柱、Ag柱、Na柱及有機相針式濾器,去除血液中的有機相及離子,棄去前面3 m L流出液后,開始收集濾液,在儀器工作條件下進行測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 前處理條件的優(yōu)化

固相萃取柱在使用前需要進行活化。RP 柱用10 m L 甲 醇 和 10 m L 水 活 化,Ag 柱 和 Na 柱 用10 m L水活化,流量均為1 m L·min－1,活化時間均為30 min。

用乙腈沉淀蛋白后,血液樣品中還殘留大量脂肪、碳水化合物等有機成分,會與氫氧化鉀淋洗液發(fā)生皂化反應,造成色譜圖中基線波動,影響色譜峰峰形和定性、定量分析結(jié)果,甚至會導致儀器損傷。本工作在用乙腈沉淀蛋白后,使用了RP 柱凈化血液樣品,可除去血液中的有機成分。

人血液中大量存在的Cl－和Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金屬離子會影響草甘膦的峰形及其定性、定量分析。Ag柱通過Ag＋型磺酸樹脂可以去除Cl－,Na柱通過Na＋型磺酸樹脂可以去除Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金屬離子,保護色譜柱不被傷害。

本工作考察了使用RP 柱、RP 柱＋Ag柱、RP柱＋Ag 柱＋Na柱時對血液樣品中 Cl－和 Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金屬離子的對應色譜峰強度和回收率的影響,見表1。

表1 經(jīng)過不同萃取柱處理后血液樣品中草甘膦和氨甲基膦酸的峰面積和回收率(n＝3)Tab．1 Peak areas and recovery of glyphosate and aminomethylphosphonic acid in blood samples treated with different extraction columns(n＝3)

過RP柱＋Ag柱＋Na柱后,血液中Cl－的回收率為0．211%,而草甘膦和氨甲基膦酸的回收率均高于與99%,說明Ag柱對Cl－的去除效果很好,且對草甘膦和氨甲基膦酸的定量結(jié)果無影響。試驗選擇 RP 柱 ＋Ag 柱 ＋Na 柱 去 除 Cl－和 Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金屬離子。

2．2 色譜條件的優(yōu)化

在儀器工作條件下,使用Dionex IonPac AS-19高容量陰離子分析柱及IonPac AG-19保護柱可以實現(xiàn)血樣中草甘膦、氨甲基膦酸與等干擾組分的良好分離,草甘膦和氨甲基膦酸的保留時間分別為17．25,18．38 min。草甘膦和氨甲基膦酸的色譜圖見圖1。

2．3 標準曲線、檢出限和測定下限

按儀器工作條件對混合標準溶液系列進行測定,分別以草甘膦的質(zhì)量濃度和氨甲基膦酸的質(zhì)量濃度為橫坐標,兩者對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線,草甘膦和氨甲基膦酸的質(zhì)量濃度均在0．01～10 mg·L－1內(nèi)與其對應的峰面積呈線性關(guān)系,線性方程分別為y＝0．056 8x＋0．001 5和y＝0．052 5x－0．003 9,相關(guān)系數(shù)分別為 0．999 3,0．999 1。

圖1 草甘膦和氨甲基膦酸的色譜圖Fig．1 Chromatograms of glyphosate and aminomethylphosphonic acid

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),草甘膦和氨甲基膦酸的檢出限分別為2．88,2．36μg·L－1;以10倍信噪比計算測定下限(10S/N),草甘膦和氨甲基膦酸的測定下限分別為9．52,7．87μg·L－1。

2．4 精密度和回收試驗

分別取0．05,1,10 mg·L－1的草甘膦和氨甲基膦酸混合標準溶液,在儀器工作條件下平行測定5次,計算測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)分別為2．3%,1．0%,0．029% 和 6．5%,6．1%,0．032% 。

以空白血液樣品為基底,分別添加0．05,1,10 mg·L－1等3個不同濃度水平的草甘膦和氨甲基膦酸混合標準溶液,按照試驗方法進行測定,草甘膦回收率分別為74．0%,96．7%,99．3%,氨甲基膦酸的回收率為79．6%,95．5%,97．0%。

2．5 樣品分析

2017年6月,清鎮(zhèn)市王某與其丈夫吵架服用大量草甘膦農(nóng)藥(約300 m L),被家人送往醫(yī)院就診,提取王某血液用本法進行測定,得到其血液中草甘膦質(zhì)量濃度為1．06 mg·L－1,氨甲基磷酸質(zhì)量濃度為0．17 mg·L－1。

本工作采用固相萃取-離子色譜法測定了血液中的草甘膦及其代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸,該方法具有準確、靈敏的特點,可用于公安機關(guān)對血液中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的分析。