包覆銪配合物Eu(DBM)3 phen的硅膠納米熒光檢測材料的制備

金 權，馬紅彥，胡 飛，王世革，劉 璐，黃明賢

(上海理工大學 理學院 化學系,上海200093)

介孔二氧化硅納米球(MSNs)具有許多獨特的性能,如良好的化學和熱穩定性、高的比表面積、較大的孔體積、較窄的孔徑分布(2～10 nm)、良好的生物相容性和易于表面修飾等[1]。這些特性使MSNs在生物檢測和生物醫療領域的應用中倍受青睞[2]。MSNs最典型的合成方法是十六烷基三甲基溴化銨(CTAB,一種陽離子表面活性劑)膠束模板法[3-9];與CTAB 單模板法相比,雙模板法(雙表面活性劑法)可以擴大MSNs孔徑[7-10],有利于孔內物質裝填量的增加、負載量的提高及后續的納米球表面修飾工作的進行。黃明賢課題組選用了CTAB和Capstone FS-66(一種短鏈碳氟陰離子表面活性劑)在弱堿性條件下合成了大孔徑樹枝狀介孔硅膠納米球[11],這種介孔硅膠納米球的孔徑、粒徑和均勻性均可通過試驗參數進行調節。

MSNs可作為制備熒光納米顆粒的基質[12-14]。稀土銪配合物具有發光強度高、半峰寬窄、色彩純度高等優點,已成為一種理想的發光材料[15]。在眾多Eu3＋配合物中,Eu(DBM)3phen熒光強度和紅光純度均很高,將其摻雜到MSNs中,不僅可以改善稀土配合物的熒光發光性能,還能顯著增加其化學穩定性[15-17]。和激光染料相比,稀土Eu3＋配合物Eu(DBM)3phen在MSNs中雖然不會表現出熒光消退現象[18],但由于兩者是通過物理吸附作用進行連接的,易出現Eu(DBM)3phen從MSNs孔道泄漏的現象,限制了其應用。MALBA 等[19]考察了在MSNs 表面修飾不同硅烷偶聯劑時對[Eu(DBM)3phen]熒光性能的影響,結果表明Eu(DBM)3phen/SiO2復合微球表面在經過硅烷試劑[如:(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(APTES)]修飾后,其熒光強度得到了提高。吳大輝等[20]在Eu(DBM)3Phen/SiO2表面包覆了一層厚約10 nm的γ-甲基丙烯酰氧基三甲基硅烷(KH570),通過形成的核-殼結構解決了Eu(DBM)3Phen 泄漏的問題。本工作在吳大輝等[20]的研究基礎上,首先利用雙模板法制備了表面含氯丙基的大孔徑樹枝狀介孔硅膠納米球,然后采用聚乙烯亞胺(PEI)對其孔道表面進行鍵合來提高其對Eu(DBM)3phen的吸附作用。然后,用PEI和聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-馬來酸)鈉 鹽 (PSSMA)等 2 種 聚 電 解 質 在Eu(DBM)3Phen/SiO2-Cl-PEI納米球表面進行層層自組裝(LBL),并在其表面包覆一層二氧化硅。最后,為了讓包覆后的納米球能夠與抗體或DNA 等分子連接,又對納米球的表面進行了修飾,使其表面富含氨基。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

JEM 2011型透射電子顯微鏡(TEM);Philips XL30型掃描電子顯微鏡(SEM);Nicolet is5 型傅里葉變換紅外光譜儀(FITR);Nano Brook 90plus Zeta型激光粒徑儀;F-7000型熒光分光光度計;U-3900型紫外-可見分光光度計;NUAIRE-C200V-E型高速臺式離心機;DHG-9030A 型電熱鼓風干燥箱;IKA MS-3型數顯型圓周振蕩器;Cascada I型超純水機;ME 204E/02型電子天平;DQ-300DE 型超聲波清洗器;DF-101S型磁力攪拌器;DZF-6055型真空干燥箱;IKA RV 8 V-C型旋轉蒸發儀。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為優級純;四乙氧基硅烷(TEOS)、三乙醇胺(TEA)、二氯甲烷、無水乙醇、氨水、異丙醇、丙酮、乙二醇、甲苯、CTAB、氫氧化鈉、Capstone FS-66均為分析純;乙烯基三乙氧基硅烷、硝酸銨均為化學純,γ-氯丙基三乙氧基硅烷純度為98%,苯基三乙氧基硅烷純度為99%,二苯甲酰甲烷(DBM)純度為99%;氯化銪六水合物(EuCl3·6H2O)純度為99．0%,1,10-鄰菲啰啉鹽酸鹽純度為98%,PEI純度為99%,PSSMA(4-苯乙烯磺酸和馬來酸的物質的量之比為3∶1),γ-氨丙基三乙氧基硅烷純度為99%。試驗用水為超純水。

1．2 試驗方法

1．2．1 MSNs的制備

根據對文獻[11]報道的雙模板法稍做改動的方法合成 MSNs。將1．92 g CTAB、0．35 m L TEA、0．32 g Capstone FS-66、100 m L 水 混 合 置 于250 m L的錐形瓶中,混合后超聲15 min,置于磁力攪拌器上,在60 ℃下攪拌反應1 h。將15 m L TEOS和15 m L 無水乙醇的混合溶液加入上述250 m L錐形瓶中,在該溫度下繼續攪拌反應5 h。然后以10 000 r·min－1的轉速離心5 min,將得到的沉淀物分別用無水乙醇洗滌2遍、丙酮洗滌1遍,然后用飽和的硝酸銨乙醇溶液淹沒沉淀,在60℃下磁力攪拌5 h或者在550℃空氣氛圍中煅燒5 h,除去表面活性劑,最后置于鼓風干燥箱中,在80 ℃下干燥過夜。

1．2．2 含氯官能團的MSNs的制備

將1．92 g CTAB、0．35 m L TEA、0．32 g Capstone FS-66、100 m L 水置于250 m L 錐形瓶中,混合溶解,混合后超聲15 min,置于磁力攪拌器上,在60 ℃下攪拌反應1 h。將13．5 m L TEOS、1．5 m L含有γ-氯丙基的硅烷偶聯劑和15 m L 無水乙醇的混合溶液加入250 m L 錐形瓶中,在該溫度下繼續攪拌反應5 h。然后以10 000 r·min－1的轉速離心5 min,將得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2遍、丙酮洗滌1遍,然后用飽和的硝酸銨乙醇溶液淹沒沉淀,在60℃下磁力攪拌5 h,除去表面活性劑,最后置于鼓風干燥箱中,在80 ℃下干燥過夜。含乙烯基、3-氨基丙基、苯基、三乙氧基官能團的MSNs的制備方法同上。

1．2．3 熒光配合物的制備

將1 mmol的EuCl3·6 H2O 溶于20 m L 無水乙醇中形成溶液A。取3 mmol的二苯甲酰甲烷和1 mmol的1,10-鄰菲啰啉鹽酸鹽溶于50 m L 無水乙醇中形成澄清溶液B,置于250 m L 的錐形瓶中。將A 逐滴加入B 中形成混合溶液后,置于60 ℃的水浴鍋中進行磁力攪拌反應。攪拌反應的同時,用飽和氫氧化鈉乙醇溶液調節混合溶液的酸度至p H 7,當出現大量的黃色沉淀時,停止攪拌,以10 000 r·min－1的轉速離心5 min,將得到的沉淀物用體積比為3∶1的乙醇-水溶液洗滌多次后,置于真空干燥箱中,80 ℃ 干燥過夜,得到Eu(DBM)3phen。

1．2．4 表面修飾不同功能團修飾的MSNs對熒光配合物的吸附制備

首先將0．02 g Eu(DBM)3phen、10 m L 的二氯甲烷置于50 m L 的試管中,超聲15 min形成透明溶液。然后將0．2 g含不同功能團的MSNs分別加入上述溶液中,使形成的混合溶液中Eu(DBM)3phen的質量分數是含不同功能團的MSNs的10%。室溫下振蕩反應6 h,以10 000 r·min－1的轉速離心5 min,得到的沉淀物分別用無水乙醇和丙酮洗滌2遍,置于真空干燥箱中,在50 ℃下干燥10 h。

1．2．5 含氯功能團的MSNs表面嫁接PEI

將表面修飾有含氯功能團的MSNs 0．2 g溶于30 m L 的異丙醇溶液中,并向溶液中加入0．06 g PEI,使混合溶液的PEI的質量分數約為含表面修飾有含氯功能團的 MSNs 的30%?；旌铣?0 min,并在室溫下振蕩反應24 h,以10 000 r·min－1的轉速離心5 min,將得到的沉淀物分別用異丙醇洗滌1次、無水乙醇洗滌2次,最后置于鼓風干燥箱中,在50 ℃干燥過夜,得到Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI。

1．2．6 聚電解質的層層自組裝吸附

將0．1 g Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI、質量分數為0．5%的 PSSMA 溶液10 m L、10 m L 的水混合,超聲5 min混勻后振蕩反應1 h。以10 000 r·min－1的轉速離心5 min,在5 ℃下將得到的沉淀物用0．05 mol·L－1的氯化鈉溶液分散洗滌2次,以去除未參與反應的聚電解質。在洗滌好的固體中加入質量分數為0．5%的PEI溶液10 m L和10 m L的水溶解,超聲5 min 混勻后,振蕩反應1 h。以10 000 r·min－1的轉速離心5 min,用0．05 mol·L－1氯化鈉溶液洗滌2次,將洗滌好的固體按照上述方法,再依次使用質量分數為0．5%的PSSMA 溶液和質量分數為0．5%的PEI溶液按照以上方法再包覆2次。

1．2．7 二氧化硅包覆

將已層層自組裝的含銪配合物的MSNs 0．2 g分散于10 m L水中,加入質量分數為0．05%的PVP溶液 10 m L、1 m L 氨水、10 m L 乙 二醇、0．3 m L TEOS,振蕩反應6 h。其中,TEOS需要分批加入,以0．05 m L·h－1的量加入反應體系中。反應完成后,以10 000 r·min－1的轉速離心10 min,將得到的沉淀物用體積比為1∶1 的乙醇-水溶液洗滌2次,最后放入鼓風干燥箱,在60 ℃下干燥過夜。

1．2．8 表面氨基化修飾

將1．2．7 節中得到的0．50 g真空干 燥 好 的 固體、50 m L 的無水甲苯、0．3 m L 3-氨基丙基三乙氧基硅烷置于500 m L 的三頸燒瓶中,然后在120 ℃下加熱回流反應8 h,反應完成后,將得到的懸浮液以10 000 r·min－1的轉速離心10 min,沉淀物用甲苯和無水乙醇離心洗滌,然后放在真空干燥箱中,在60 ℃下干燥24 h。

熒光納米球制備過程示意圖見圖1。

圖1 熒光納米球的制備示意圖Fig．1 Schematic diagram of preparation of the fluorescent nanospheres

2 結果與討論

2．1 MSNs的SEM 及 TEM 形貌

CTAB和Capstone FS-66 混合均勻形成膠束后,在TEA 弱堿性條件下,TEOS水解并縮聚形成大孔徑樹枝狀MSNs,MSNs的SEM 圖和TEM 圖見圖2。

圖2 MSNs的SEM 圖和 TEM 圖Fig．2 SEM and TEM images of the MSNs

由圖2 的SEM 和 TEM 圖可以看出:合成的MSNs具有單分散性高、顆粒大小均勻、孔徑較大等特點,納米球粒徑約為170 nm,比單模板法合成的MSNs的大。在使用典型的單模板法制備MSNs時,CTAB形成帶正電的膠團模板,TEOS水解縮合得到帶負電的硅膠低聚物,由于靜電作用,兩者發生相互作用,通過自組裝效應,硅膠低聚物在CTAB膠團作用下縮聚成二氧化硅納米粒子。當納米球表面所帶負電荷足以去抑制納米粒子的進一步生長時即形成了穩定的納米球形態。本試驗選擇了CTAB和Capstone FS-66雙模板法。相對于其他表面活性劑,Capstone FS-66具有高化學穩定性、高表面活性、在較低含量下也能較大程度地降低水溶液的表面張力等優點,可改變CTAB 膠團模板的性質:一是在CTAB膠團模板中作為膨脹劑擴大了MSNs的孔徑,有利于增加孔內物質裝填、負載量的提高及后續的納米球表面修飾工作的進行;二是在降低了CTAB膠團的表面張力同時,還可能減少水-CTAB膠團界面的曲率。CTAB 和Capstone FS-66 雙模板系統熱力學系統更穩定、分散性更好、與硅膠低聚物的作用比CTAB單模板系統更小,形成的MSNs單分散性更好、粒徑和孔徑更大。

2．2 表 面 修 飾 不 同 官 能 團 的 MSNs 對Eu(DBM)3 phen配合物的熒光性能的影響

對1．2．4節合成的含γ-氯丙基、苯基、乙烯基、3-氨基丙基的熒光納米球[Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl、Eu(DBM)3phen/SiO2-C6H6、Eu(DBM)3phen/SiO2-C2H4、Eu(DBM)3phen/SiO2-NH2]及不用硅烷偶聯劑修飾的熒光MSNs[Eu(DBM)3phen/SiO2]的熒光性能進行了考察,見圖3。

圖3 含不同官能團的納米球的熒光發射光譜Fig．3 Fluorescence emission spectra of the nanospheres containing different functional groups

由圖3的熒光發射光譜可看出:各物質均在波長613 nm 處有著強而尖的熒光發射峰,同時由于納米球表面所含功能團不同,吸附熒光物質的能力也有著顯著的差異,含氯官能團的MSNs吸附熒光配合物的效果最佳,其熒光強度約2 000 a．u。

2．3 Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI的表面電性能及熒光性能

PEI作為一種水溶性高分子聚合物,含有伯胺、仲胺和叔胺等功能基團,對金屬離子具有很強的絡合能力。通過在Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl表面嫁接 PEI,可 增 強 MSNs 對 熒 光 配 合 物Eu(DBM)3Phen的吸附能力。為考察PEI熒光增強的效果,對PEI修飾前后的納米球進行了Zeta電位和熒光測試,結果見表1和圖4。

表1 Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl與Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI的Zeta電位Tab．1 Zeta potential of Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl and Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI

由表1可以看出:Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl的Zeta電位為負值,在嫁接PEI后,Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI的Zeta電位變為正值,且數值明顯增大,說明PEI成功嫁接在Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl表面。

由圖4 可以看出:Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI熒光強度為4 120 a．u,遠大于修飾前的Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl 的 熒 光 強 度 (約2 000 a．u),說明納米球的孔道表面經PEI修飾后,對Eu(DBM)3phen吸附能力明顯增強。

圖4 Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI的熒光發射光譜Fig．4 Fluorescence emission spectrum of Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI

2．4 Eu(DBM)3 phen/SiO2-Cl-PEI包覆二氧化硅后的表面電性能、熒光性能和TEM 形貌

為了防止Eu(DBM)3phen從納米球內泄漏出來,保持熒光納米球的穩定性,還需要在熒光介孔二氧化硅納米球(Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI)表面實施包覆。本試驗先是采用2種聚電解質材料通過層層自組裝技術對納米球表面進行多層包覆,然后又在納米球表面包覆了一層二氧化硅。因二氧化硅具有很好的穩定性且表面易被修飾,可繼續在納米球表面進行氨基化修飾,從而建立與抗體或DNA等分子的連接。為了考察納米球的包覆效果,對其Zeta電位進行了考察,結果發現,包覆后納米球的Zeta電位為－29．26 m V,遷移率為－2．29 V·cm－1,頻率為230．24 Hz,頻移為－20．00 cm－1,和SiO2包覆前的表面電性能相比,Zeta電位變為負值,說明二氧化硅成功包覆在Eu(DBM)3phen/SiO2-Cl-PEI的表面,因為二氧化硅在p H＞7的溶液測試環境下表面顯示電負性,此外,還對包覆后微球的熒光強度和TEM 形貌進行了考察,見圖5和圖6。

由圖5可以看出:納米球在經過多次包覆和洗滌后,熒光強度約為2 800 a．u,是包覆前的熒光強度(4 120 a．u)的68%,說明在其表面包覆二氧化硅后依然保持良好的熒光強度。

圖5 二氧化硅包覆后微球的熒光發射光譜Fig．5 Fluorescence emission spectrum of the nanospheres after coating with silica

圖6 SiO2 包覆后納米球的TEM 圖Fig．6 TEM image of nanospheres after coating with SiO2

由圖6 可以看出:納米球直徑增大到約230 nm,MSNs的樹枝狀孔結構已完全被表面形成的SiO2層覆蓋了,有利于解決熒光配合物的泄漏問題及繼續在納米球表面進行氨基化修飾,從而建立與抗體或DNA 等分子的連接。

2．5 氨基化修飾后納米球的紅外譜圖

為了使二氧化硅包覆好的納米球可以與抗體、DNA 等生物分子連接,需對其表面進行修飾,其中氨基化修飾是最常用的方法[21]。為了考察氨基修飾前后微球表面官能團的變化,進行了FTIR 測試,見圖7。

圖7 未修飾氨基(a)和已修飾氨基(b)的MSNs的紅外光譜圖Fig．7 FTIR spectra of the MSNs with unmodified amino groups and modified amino groups

由圖7可知:1 082 cm－1處存在的強而寬的吸收峰屬于 Si－ O －Si 的反對稱伸縮振動;3 431 cm－1處的強而寬的吸收峰屬于Si－O－H 的伸縮振動和O－H 的伸縮振動;1 639 cm－1處的吸收峰是H－O－H 的彎曲振動峰,953 cm－1處的吸收峰屬于Si－OH 的振動吸收峰;790 cm－1的吸收峰是Si－O 的對稱伸縮振動峰,由此可得出,微球表面的物質為二氧化硅。比較兩條曲線,曲線(b)在1 543 cm－1處出現了新吸收峰,為氨基的彎曲振動峰,說明微球表面已經修飾上了氨基官能團。

本工作先用雙模板法合成了樹枝狀MSNs,然后在其納米球孔道內修飾了含氯功能團和PEI,修飾過的 MSNs 可以更有效地吸附熒光配合物Eu(DBM)3phen。為了增加熒光配合物納米球的穩定性,在熒光介孔二氧化硅納米球表面層層自組裝包覆聚合物電解質后進一步包覆二氧化硅層。最后在其表面進行氨基化修飾,從而可以在下一步工作中使其與抗體分子連接,達到在熒光免疫分析中標記生物分子的目的。