實時熒光定量PCR技術及其應用研究進展

梁子英 劉芳

摘要? ? 實時熒光定量PCR技術是在傳統PCR技術上發展而來的，不僅能判斷某一基因的有無，而且還能對其進行定量分析。由于該技術與常規PCR相比，能夠進行實時監測、自動化程度高而被廣大研究者青睞。本文對實時熒光定量PCR的原理、數據分析、定量方法、分類以及應用進行了系統而詳細的綜述。

關鍵詞? ? 熒光定量PCR;原理;定量方法;分類;應用

中圖分類號? ? Q503? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）06-0001-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Research? Progress? on? Real-time? Quantitative? PCR? Technology? and? Its? Application

LIANG Zi-ying? ? LIU Fang *

（College of Biological Sciences，China Agricultural University，Beijing 100193）

Abstract? ? Real-time quantitative PCR technology is developed from traditional PCR technology.It can not only judge the presence or absence of a certain gene，but also perform quantitative analysis on it.Compared with conventional PCR，this technology is capable of real-time monitoring and has a high degree of automation，which is favored by researchers.In this paper，the principles，data analysis，quantitative methods，classification and applications of real-time quantitative PCR were reviewed systematically and in detail.

Key words? ? real-time quantitative PCR;principle;quantitative method;classification;application

1? ? 實時熒光定量PCR技術的原理及數據分析

1.1? ? 實時熒光定量PCR的原理

實時熒光定量PCR與常規PCR相比，主要體現在熒光、實時與定量3個關鍵詞上。熒光是指在標準PCR體系中加入了熒光物質;實時是指通過熒光信號的積累能夠實時監測每次循環后PCR產物的變化，并生成熒光擴增曲線;定量是指該技術能夠實現對初始模板的定量分析。

實時熒光定量PCR的擴增曲線可由4個時期進行描述，即基線期、指數增長期、線性增長期與平臺期。在基線期部分，強背景信號掩蓋了微弱的熒光信號，故此時期無法對模板的起始量進行分析。反應進入平臺期，反應管內的dNTP、酶等被耗盡，反應環境已不適合PCR反應的進行，此時的PCR產物不再增加，熒光信號達到水平狀態，且同一模板的多次技術重復的擴增曲線在該時期重復性差、可變性高，故在這一時期同樣不適合進行模板初始量的分析。在線性增長期，雖然PCR反應仍在進行，但產物已不再呈指數形式增加，在該時期也不適合模板初始量的分析。在指數增長期，反應各組分（引物、dNTP、Mg+、酶）均過量，反應所需的環境適中，聚合酶活性仍較高，該時期的擴增效率高，產物數量以指數形式增加，且與初始模板量成線性相關[1]。另外，在指數增長期內，同一模板的多個技術重復具有高度的重復性，在這一時期進行數據分析具有可靠性。

實時熒光定量PCR中的3個概念，即基線、閾值與CT值是理解其原理的關鍵。在線性圖譜中，基線體現在與X軸平行的部分，對數圖譜中，它體現在背景信號雜亂的部分，系統會自動形成基線的起始循環數與終止循環數，也可手動調節。熒光閾值指的是熒光強度值，將它界定為3～15個循環的熒光信號標準差的10倍[2]，在擴增曲線里，穿過閾值與X軸形成的平行線即為閾值線，系統可自動形成也可手動設置，手動設定閾值時，在指數增長期內重復性好的范圍內上下調節。CT值是指熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環次數[3]，與靶點的初始量成反比。整個擴增過程，基線決定閾值，閾值決定CT值，為了保證試驗結果的準確性，需保證擴增曲線的基線以及閾值設置的合理性。系統一般將基線起始循環數設為3，正確的基線終止循環數很重要，若背景信號過強，系統會將背景信號誤判為擴增信號，自動生成的基線范圍比實際范圍小，影響擴增曲線的帶型以及最終檢測到的CT值，這種情況可手動設置基線終止循環數，一般將其設為該樣品開始擴增的前一個循環。

1.2? ? 實時熒光定量PCR的數據分析

在指數增長期，PCR產物量以指數形式增加，根據這一原則，假設擴增效率為E，模板起始量為N0，m個循環后PCR產物量為Nm，則有Nm=N0（1+E）m（1），對該等式兩邊取對數，則有LgN0=-m·lg（1+E）+Lg Nm（2），若循環數達到某一CT值時，熒光閾值為Q，式（1）可寫成：Q=N0（1+E）CT，式（2）可寫成：LgN0=-CT·lg（1+E）+LgQ。當需要對靶基因在mRNA水平上進行表達量分析時，通常采用式（1）進行數據分析。當需要對靶基因拷貝數進行絕對定量時，則需要用式（2）進行數據分析。

2? ? 實時熒光定量PCR技術的定量方法

“絕對定量”與“相對定量”是實時熒光定量PCR的2種定量方法[4]，研究者可選擇適合自身研究的定量方法。

2.1? ? 絕對定量法

絕對定量法也稱作標準曲線法[5]，是一種利用已知的標準曲線來定量未知樣本目的模板起始量的方法。以5點梯度稀釋所得的標準品為模板，經實時熒光定量PCR擴增，以目的模板初始拷貝數的對數為橫坐標，檢測到的CT值為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程，將未知樣本的CT值帶入該方程即可計算出目的模板的起始量。標準曲線的各項指標：斜率、擴增效率（E）、相關系數（R2）、間距均需進行嚴格評價，從而確保該曲線的可用性。各點間距應相等，間距以及斜率的絕對值應滿足3.100～3.582，相關系數R2>0.99，擴增效率（E）在90%～110%之間。擴增效率、斜率以及間距三者相互關聯，擴增效率（E）=10（-1/斜率）-1，斜率的絕對值恰是各點之間的平均間距。當擴增效率<90%時，間距以及斜率的絕對值會>3.582;當擴增效率>110%時，間距以及斜率的絕對值會<3.10，故擴增效率越低，斜率的絕對值越大，間距越寬;擴增效率越高，斜率的絕對值越小，間距越窄。擴增效率過低，酶的活性可能出現了問題，或反應體系不適合反應的有效進行。若擴增效率過高，反應管內可能存在目的基因擴增之外的其他非特異擴增，需要對引物進行一個溶解曲線的檢測，優化反應體系以及反應程序。

2.2? ? 相對定量法

相對定量可分析某一靶基因在不同樣品之間、同一樣品的不同部位之間以及某一樣品的某一部位在不同動態時期之間的mRNA水平上表達量的比值，也可分析靶基因與內參基因在同一樣品中拷貝數的比值。在相對定量中，需要用內參基因來消除因模板濃度不同所帶來的誤差，進而對靶基因的初始量進行校正[6]。常用的有2-ΔΔCT法[7]，雙標準曲線法[8-9]。

2.2.1? ? 2-ΔΔCT法。使用該方法的前提是靶基因與內參基因的擴增效率相等且均為100%[10]，假設靶基因在處理組與對照組中的初始量分別為N1與N2，當達到某一熒光閾值時，靶基因在處理組與對照組中的閾值循環數分別為CT1與CT2，則有C1·N1·2C2·N2·2（C1、C2分別為處理組與對照組的濃度），假設內參基因在處理組與對照組中的初始量分別為N1′與N2′，當達到某一熒光閾值時，內參基因在處理組與對照組中的閾值循環數分別為CT1′與CT2′，則有C1·N1′·2=C2·N2′·2，故有，C1·N1·2/C1·N1′·2=C2·N2·2/C2·N2′·2，由于內參基因在處理組與對照組中的初始量是相同的，即N1′=N2′，故靶基因在處理組與對照組中的比值N1/N2=2，即N1/N2=2-ΔΔCT，其中ΔΔCT=ΔCT處理組-ΔCT對照組=（CT靶基因-CT內參基因）處理組-（CT靶基因-CT內參基因）對照組。該方法不需要生成標準曲線，操作簡便、效率高，但靶基因以及內參基因的擴增效率需達100%。此方法通常用于某一基因在mRNA水平上的表達量分析。

2.2.2? ? 雙標準曲線法。雙標準曲線即靶基因以及內參基因各對應的一套標準曲線。假設靶基因的平均擴增效率為E3，在待測樣品以及校準樣品中的初始拷貝數分別為N3與N4，當達到某一閾值時，該靶基因在待測樣品以及校準樣品中檢測到的CT值分別為CT3與CT4，則有C3·N3·（1+E3）=C4·N4·（1+E3）（其中，C3與C4分別為待測樣品以及校準樣品的濃度），假設內參基因的平均擴增效率為E4，內參基因在待測樣品以及校準樣品中的初始拷貝數分別為N3′與N4′，當達到某一閾值時，內參基因在待測樣品以及校準樣品中檢測到的CT值分別為CT3′與CT4′，則有C3·N3′·（1+E4）=C4·N4′·（1+E4），則靶基因與內參基因在待測樣品中的拷貝數比值N3/N3′=N4/N4′·（（1+E3）/（1+E4）），其中，N4為靶基因在校準樣品中的初始拷貝數，校準樣品中靶基因的拷貝數是已知的，并且是經過Southern雜交驗證的;N3′與N4′是指內參基因在待測樣品以及校準樣品中的初始拷貝數，在拷貝數變異檢測中，內參基因需具有“同一物種內具有恒定低拷貝”這一特點，也就是N3′=N4′，故靶基因在待測樣品中的初始拷貝數N3=N4·（1+E3）/（1+E4）。利用該方法需生成標準曲線，操作嚴謹復雜，但計算結果準確，誤差小，對結果要求較高的分析通常采用該方法。

3? ? 實時熒光定量PCR技術的分類

3.1? ? DNA染料法

用于實時熒光定量PCR的DNA染料有SYBR Green I、SYBR Gold、EvaGreeEB與EB。SYBR Green I是目前試驗過程中最常用的一種，該染料結合于雙鏈DNA的小溝處[11]，游離的染料分子只發出微弱的熒光，錨定到雙鏈DNA上的染料才會發出強熒光。在PCR延伸階段，SYBR Green I染料結合上去，發出熒光，雙鏈合成越多，熒光強度越強。SYBR Green I與DNA的結合具有非特異性，除了與目的片段結合外，還能與其他非目的片段的雙鏈DNA分子結合，如非特異性擴增產物、引物二聚體。為了檢測產物中是否含有非特異或引物二聚體，在PCR反應結束后進行一個溶解曲線分析，即溫度從50 ℃升高到95 ℃，監測這一過程中熒光信號的變化情況，用熒光信號變化的速度與溫度作圖，形成溶解曲線，若未形成非特異或引物二聚體，特征峰只有1個，且相同基因形成特征峰的Tm值相同;若有非特異或引物二聚體時，就會出現特征峰之外的雜峰。由于染料法對雙鏈DNA的識別不具有特異性，所以試驗過程中需要合理地設計引物。

3.2? ? 熒光探針法

熒光探針是指在寡聚核苷酸上結合熒光報告基團與熒光淬滅基團，由激發態的報告基團回到基態的過程會釋放熒光，當報告基團與淬滅基團離得很近時，激發態的報告基團會將熒光傳遞給淬滅基團從而不發射熒光。熒光探針法大體上分為水解探針法、雙聯置換探針法和雜交探針法。

3.2.1? ? 水解探針法。水解探針的結構特點是寡核苷酸序列的5′端為熒光報告基團，3′端為熒光淬滅基團。PCR擴增前，探針游離于靶序列外，報告基團發出的熒光被淬滅基團吸收，檢測不到熒光，但有時會因淬滅不徹底，會檢測到微弱的熒光。在PCR退火時，探針特異性地結合到靶序列上，在延伸階段，利用Taq酶5′-3′外切酶的活性將探針水解，熒光報告基團與熒光淬滅基團分離，熒光信號被釋放，并與PCR產物的數量成正相關。由于水解探針的作用機理依賴于Taq酶5′-3′外切酶的活性，所以水解探針又稱為Taqman探針。

在Taqman探針的基礎上研發出了Taqman MGB探針，該探針的3′端除了有淬滅基團外，增加了一種MGB基團，該基團能夠與雙鏈DNA的小溝結合，使探針與靶序列的親和力增強，探針Tm可提升10度左右，長度可適當減少，降低了合成成本[3]。另外，Taqman MGB探針3′端的淬滅基團本身不發熒光，從而降低了熒光本底信號。

3.2.2? ? 雙鏈置換探針法。雙鏈置換探針的特點是由正負兩條鏈組成，互補結合，正鏈的5′端標記有熒光基團，3′端通過結合磷酸基團或氨基基團來阻止其延伸，負鏈的5′端比正鏈少1～5個堿基，3′端標記有淬滅基團。當體系中無靶序列時，正鏈與負鏈處于結合狀態，兩端的熒光基團離得很近，檢測不到熒光信號，當有靶序列存在時，正鏈就會與靶序列結合從而將負鏈釋放出去，2條鏈上的熒光基團分離，能檢測到熒光信號。相較與水解探針，雙鏈置換探針的熒光基團以及淬滅基團相互作用得更牢固，產生的本底信號更低[12]。

3.2.3? ? 雜交探針。雜交探針中最常用的是分子信標與雙雜交探針。游離狀態下的分子信標是一種“莖-環”結構，其環狀部位與靶序列互補結合，兩側的莖臂互補結合，且與靶序列無同源性，在兩側莖的3′與5′端分別標記有熒光報告基團與淬滅基團。當分子信標游離于靶序列時，兩莖臂上的熒光基團離得很近，檢測不到熒光，在PCR退火階段，環狀部位與靶序列結合，兩莖臂的互補結構被破壞，兩端的熒光基團分離，熒光信號被釋放。

雙雜交探針是由一對探針組成，其結構特點是2條探針能夠與靶序列上的相鄰部位結合[13]，其中一個探針的5′端為熒光受體基團，另一個探針的3′端為熒光供體基團。在退火階段，兩探針以首尾相接的方式結合到靶序列上，2個基團離得很近，供體基團激發后產生的熒光能量被受體基團吸收，此時可以檢測到受體發出的熒光。當這對探針處于游離狀態時，2個基團離的遠，檢測不到受體基團發出的熒光。

4? ? 實時熒光定量PCR技術的應用

由于實時熒光定量PCR技術較常規PCR技術相比，具有污染少、定量準確、實時監測、自動化程度高等優點，該技術已被應用于轉基因檢測、作物育種、環境科學以及醫學等領域。

4.1? ? 在轉基因生物中的應用

4.1.1? ? 在轉基因成分檢測中的應用。開發與完善轉基因成分檢測技術已成為對轉基因產品進行標識管理，進而維護消費者知情權的一種必然趨勢。標識的閾值是指產品中含有的轉基因作物的百分比，這就需要轉基因檢測方法不能僅僅停留在定性檢測上，還需要進行定量檢測，實時熒光定量PCR技術是目前廣泛應用的定量檢測技術。自Vaitilingom等[14]首次將該技術應用到轉基因產品的定量檢測上以來，該技術已被廣泛應用于玉米、大豆、水稻、小麥、番木瓜等轉基因生物目的基因的定量檢測中[15-19]。熒光定量PCR技術不僅能夠實現單一基因的檢測，還能同時實現多個基因的檢測，在保證準確性的同時大大提高了通量。

4.1.2? ? 在轉基因新品種育種過程中的應用。在轉基因過程中，外源基因的插入位點以及數目都是隨機的，插入的拷貝數低（1或2），能很好地表達，拷貝數高反而表達不穩定甚至沉默。因此，必須對轉基因T0代的拷貝數進行檢測，保留低拷貝（1或2拷貝），棄掉高拷貝。T0自交得到的T1是處于分離狀態的，當T0為1拷貝時，T1會出現0、1、2這3種拷貝數類型，0拷貝的植株是不含外源基因的，在壓力篩選過程中被淘汰，1拷貝的T1單株在自交下一代中仍會出現分離，2拷貝單株的自交后代仍為2拷貝，不再分離，故2拷貝單株是純系單株。當T0為2拷貝時，T1會出現0、1、2、3、4這5種拷貝數類型，1、2、3這3種拷貝數類型的單株的下一代仍會出現分離，4拷貝單株的自交后代拷貝數仍為4，不再分離，在此種情況下，4拷貝單株是純系單株。為了更快更早地拿到純系單株，通過檢測T1單株外源基因的拷貝數即可判斷出純系單株，再通過對T2代進行拷貝數檢測，完成純系驗證，通過這種方式可以快速準確地拿到純系種子。通過檢測T0以及T1植株外源基因的拷貝數即可拿到純系T1單株，最終，純合的T1自交可得到純合的T2種子，再對純合的T2植株進行表達量分析，只有對純合的、過表達的T2植物的表型及功能的研究才是有意義的，用該方式獲得過表達的純系T2，與傳統的育種方法相比，大大地縮短了育種年限。然而，無論在T0、T1以及T2中的外源基因拷貝數的檢測，還是對純合T2的表達量分析，均可以通過實時熒光定量PCR技術來實現，準確性高，通量大，適用于大批次樣品的檢測。

4.2? ? 在農作物育種中的應用

分子標記輔助育種中的單核苷酸多態性標記SNP技術因在全基因組中覆蓋率廣、圖譜密度高而被廣泛地開發與利用。SNP位點的檢測方法有測序法、單鏈構象多態性分析法、變性高效液相色譜法、寡核苷酸鏈連接分析法、基于熒光定量PCR的Taqman探針法與HRM法。其中，測序法、單鏈構象多態性分析法與變性高效液相色譜法均因成本高、通量低而未得到廣泛使用，寡核苷酸鏈連接分析法由于可操作性差也未被廣泛使用?；跓晒舛縋CR的Taqman探針法與HRM法因其通量高、在封閉的環境中進行反應、污染率低等優點而被廣泛地利用。

4.3? ? 在其他方面的應用

熒光定量PCR技術在食品監測以及環境監測中均有應用。食品中可能含有一些有害的細菌，利用熒光定量PCR技術可對食品中的某一細菌進行定量分析[20]，靈敏度和可靠性高。環境中的微生物[21]，如大氣環境中的大腸桿菌，水環境中的藍細菌、赤潮藻、假單胞菌，土環境中的炭疽芽孢桿菌是否超標，嚴重影響著人類、水生生物以及植物的健康生長，熒光定量PCR技術能對其實現定量分析，對環境進行檢測。另外，熒光定量PCR技術也廣泛應用于醫學，如癌癥的診斷、病原體的感染以及基因缺陷性疾病的檢測。

5? ? 參考文獻

[1] 王甜，陳慶富.熒光定量PCR技術研究進展及其在植物遺傳育種中的應用[J].種子，2007（2）：56-61.

[2] 王秀娟，肖瑞，姜麗麗，等.實時熒光定量PCR的原理及其醫學應用[J].疾病監測與控制，2013，7（5）：284-286.

[3] 馬月萍，戴思蘭，馬艷蓉.熒光定量PCR技術在植物研究中的應用[J].生物技術通報，2011（7）：37-45.

[4] GINZINGER D G.Gene quantification using real-time quantitative PCR：an emerging technology hits the mainstream[J].Exp Hematol，2002，30（6）：503-512.

[5] BUSTIN S A.Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays[J].J Mol Endocrinol，2000， 25（2）：169-193.

[6] HAN X，LIU M，QIAO G，et a1.Selection and validation of reference genes for real-time quantitative PCR in hyper accumulating ecotype of Sedum alfredii under different heavy metals stresses[J].PLoS 0ne，2013，8（12）：82927.

[7] PFALL M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic Acids Res，2001，29（9）：45.

[8] RUTLEDGE R G.Mathematics of quantitative kinetic PCR and theappli-cation of standard curves [J].Nucleic Acids Res，2003，31（16）：93.

[9] 徐麗華，劉春雷，常玉梅，等.雙標準曲線相對定量PCR試驗原理與方法[J].生物技術通報，2011（1）：70- 75.

[10] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delt Delt C（T））Method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[11] NAVARRO E，SERRANO-HERAS G，CASTANO M J，et al.Real-time PCR detection chemistry[J].Clinica Chimica Acta，2015（439）：231.

[12] CHENG J，ZHANG Y，LI Q.Real time PCR genotyping using displacing probes [J].Nucleic Acids Res，2004，32（7）：61.

[13] DIDENKO V V.DNA probes using fluorescence resonance energy transfer（FRET）：designs and applications[J].Biotechniques，2001，31（5）：1106.

[14] VAITILINGOM M，PIJNENBURG H，GENDRE F，et al.Real-time qua-ntitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and roundup ready soybean in some representative foods[J].J Agric Food Chem，1999，47（12）：5261-5266.

[15] 陳穎，徐寶梁，蘇寧，等.實時熒光定量PCR技術在轉基因玉米檢測中的應用研究[J].作物學報，2004（6）：602-607.

[16] 吳影，宋豐順，陸徐忠，等.實時熒光PCR技術定量檢測轉基因大豆方法的研究[J].作物學報，2007（10）：1733-1737.

[17] 王育花，趙森，陳芬，等.利用實時熒光定量PCR法檢測轉基因水稻外源基因拷貝數的研究[J].生命科學研究，2007（4）：301-305.

[18] 甄貞，段俊枝，于艷波，等.轉基因小麥B73-6-1外源基因拷貝數的確定[J].河南農業科學，2016，45（4）：19-22.

[19] 任君安.玉米和番木瓜等產品中轉基因成分檢測技術研究[D].北京：北京林業大學，2013.

[20] 張慧敏，夏海磊，王夢琦，等.熒光定量PCR檢測原料乳中魯氏不動桿菌方法的建立[J].食品工業科技，2017，38（3）：309-313.

[21] 倪敏，章豪，劉婷婷，等.實時熒光定量PCR在污水處理活性污泥中的應用[J].蘇州科技大學學報（工程技術版），2019，32（1）：10-14.