CAR-T細胞技術的研發及臨床應用前景

趙 琳，趙新漢

(西安交通大學第一附屬醫院腫瘤內科，西安 710061)

CAR-T療法全稱為chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，即嵌合抗原受體T細胞免疫療法。這一概念最早由Gross等[1]于1989年提出，經過近幾年連續改進并發展后得到了非常快速的進步。CAR-T細胞技術屬于過繼T細胞療法的一種，但其鮮明的特點在于可使T細胞表面嵌合抗原受體，從而引導T細胞靶向殺傷腫瘤細胞。相對于傳統過繼細胞療法而言，CAR-T細胞技術可以繞過抗原遞呈，進入人體后能長期存活或繼續繁殖。由于CAR-T細胞療法展現出極強的技術屬性和良好的復制性，并且已經在血液系統腫瘤治療中表現出良好的臨床療效，優于現有的其他免疫細胞治療腫瘤的療效，吸引了越來越多的研發機構及臨床中心投入其中并開展大量臨床試驗。本文將著重從結構和功能出發，對CAR-T細胞技術的研發與應用做出部分闡述，并對發展迅猛的CAR-T技術進行展望。

1 CAR-T的整體結構與功能

經典的嵌合型抗原受體CAR(chimeric antigen receptor，CAR)可分為5個部分，即識別腫瘤抗原的抗體單鏈可變區、鉸鏈區、跨膜區、共刺激區和T細胞活化區。CAR-T細胞技術通過外源基因轉染技術轉染到患者的T細胞或者改造的T細胞，把識別腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA)的單鏈抗體(single-chain variable fragment，scFv)和T細胞活化序列(通常為CD3ζ或FcεRIγ)的融合蛋白表達到T細胞表面。scFv通過跨膜區與T細胞胞內的活化增殖信號域偶聯。這些改造的T細胞再經過體外純化和大規模擴增后回輸到患者體內，最終以非主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)限制性模式表現強效的抗癌作用。CAR-T細胞作用過程不受MHC限制，這在一定程度上使得CAR-T細胞技術具有多靶點性，而且對表達相同抗原的腫瘤均具有識別殺傷能力。迄今，CAR-T細胞技術主要經歷了4代研發歷程，但有研究提出第Ⅴ代應為通用型嵌合抗原受體，具體見表1。

表1 CAR-T細胞技術比較

現有研究表明，T細胞的完全活化有賴于雙信號和細胞因子的作用，例如僅含有CD3ζ序列的CAR，仍需在協同刺激信號的作用下，才能激活CAR-T細胞，這可能是第一代FRa CAR-T細胞在I期臨床試驗對晚期卵巢癌的抗腫瘤作用無效的主要原因[2]。為此，第二和第三代CARs在嵌合受體上加了如CD28、CD134和CD137等共刺激分子(costimulatory molecule，CM)，從而使T細胞激活，T細胞的殺傷毒性和增殖活性明顯增加，并且延長了T細胞的存活時間。CD28、CD134、CD137等共刺激分子在CAR作用中究竟孰優孰劣，研究結果不盡相同[3-4]。有研究認為，CD28的刺激可使CD4 T細胞保持中心記憶性細胞狀態，CD137促使CD8T中心記憶性細胞增殖[5-6]。第四代CAR-T細胞技術，包括自殺基因、整合表達免疫因子、整合共刺激因子配體等精確調控方式的加入，可能有含CD28的3個不同的共同刺激因子加入。整體上，第四代CAR-T細胞技術的研究目前更多地集中在基因修飾及免疫微環境改造層面，基因修飾(如自殺式人工調控開關的研究)方面取得了可觀的成績[7]，如，磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑的引入、MegaTAL基因編輯技術敲除TCR、PD-1敲除、CRISPR-Cas技術的引入等。免疫微環境改造是第四代CAR調控T細胞的主要研究目的之一，例如，讓第四代CAR-T共表達一個白介素-12(IL-12)因子，讓IL-12在靶點局部表達，改善免疫治療微環境，激活鄰近的自然殺傷(NK)細胞、浸潤的T細胞等[8]，從而激活內源性抗腫瘤反應。通用CAR-T細胞技術的研究將會引入更多的基因編輯技術，最大化地突破移植物抗宿主病(GVHD)這個瓶頸，最終為CAR-T細胞技術的規模化應用奠定基礎。

2 CAR-T的結構組分研究

2.1 scFV研究

嵌合型抗原受體CAR結構的第一個關鍵部位是膜外區上具有特異性識別并結合腫瘤細胞表面抗原的scFv，其形式為VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。目前能獲得的最小的具有特異性識別又能結合抗原的分子為scFv[9]，其大小約為28KD。scFv既可以與納米微球結合，也可以與各種已知的靶向治療藥物結合。直到CAR開發后，scFv的獨特作用才再一次引起人們的極大關注。對靶標分子及修飾性目的分子的親和淘選是目前獲得較特異的scFv片段分子的有效方式。其中，較為常用的篩選方法包括DNA文庫、噬菌體文庫、核糖體展示文庫等篩選文庫技術。靶點的選擇還可應用人源化抗體和親和力優化，主要技術為噬菌體抗體技術、嵌合抗體技術、基因工程抗體技術等。scFv親和淘選及識別靶點既可以利用腫瘤蛋白質抗原，又可利用糖脂類非蛋白質、碳水化合物或腫瘤特異性受體的配體等。目前世界范圍內多個中心研究較多的靶點為特定或某一類腫瘤相關抗原，而實體瘤的靶向選擇主要包括突變的抗原或病毒抗原、組織特異性抗原、組織發育特異性抗原、過表達的抗原等[[10]。綜合來看，目前常用的研究靶點有：① CD分化抗原系列：CD19(最常見)、CD20、CD22、CD30、CD33、CD107a、CD171、CDl23、CD133、CD138、CD317等；② 腫瘤標志物系列：CA125、CEA、AFP、PSMA；③ 表皮生長因子系列：Her-1、Her-2、EGFR等；④ 突變基因、酶類及其他：GD2、Mesothelin、MAGE-A3、、MUC-16、ROR-1、GPC3、DR5、TIPE3、MAGE-A3，IL-13Ra2，c-MET、CAIX等。一些改造的靶點研究在實體瘤中發展較快，如表皮生長因子受體Ⅲ型突變體(EGFRvⅢ)治療膠質瘤患者的臨床試驗正在進行中；Eureka Therapeutics公司開發了專門識別HLA-A02限制的AFP抗原多肽的人源化單克隆抗體進行人源化噬菌體文庫篩選[11]。隨著研究的進展，一些新的腫瘤靶點也被提出，成纖維細胞激活蛋白在眾多腫瘤間質中高表達，靶向該蛋白的CAR-T細胞能抑制小鼠腫瘤的生長，且無細胞毒性[12]。Tran等[13]以全基因組測序的方法，免疫靶向膽管細胞癌患者體內具有個體特征的腫瘤突變抗原靶點(erbb2基因突變)，患者病情得到控制并在觀察的6個月內持續緩解。

靶點的選擇及scFv的設計目前仍有很多問題亟待解決，尤其是在目前實體瘤無特異性靶點的現狀下。在親和性方面，增強CAR抗原親和力會提高腫瘤靶向性并伴隨抗原表達下調和T細胞激活增加，但高親和力的CAR與抗原的結合過于緊密，反而導致效應T細胞結合多種目標分子受限，從而限制殺傷效力。在療效方面，當前研究設計大都針對已知的相對較好的腫瘤相關抗原，仍缺少腫瘤特異性抗原。優化抗原篩選是靶向實體腫瘤領域的重要組成部分，但修飾后的治療可能會導致腫瘤抗原呈遞下調甚至缺失，進而導致腫瘤免疫逃逸。在靶向殺傷的進化選擇上，由于實體腫瘤可能有很多靶點陰性的細胞，因此殺傷靶點陽性的細胞后，靶點陰性的細胞可能會成長。有研究指出，喚醒浸潤的T細胞才能殺傷靶點陰性的腫瘤細胞。在鼠源性方面，目前的CAR大多基于鼠源抗體的scFv進行設計，這種異源模型可能會誘發宿主抗CAR反應。將scFv片段人源化或利用人源抗體設計CAR是阻止這種反應的可能策略之一。另外，特異性scFv的設計和獲得，也是一個較為長期而反復的篩選過程。

2.2 載體設計研究

目前應用最多的CAR-T細胞技術仍是以病毒作為載體中介[14]，其中最為常見的仍是反轉錄病毒和慢病毒。兩者均具有出色的基因轉導效率，而慢病毒的感染效率更高，表達更持久且能傳遞大片段DNA序列[15]。人們對其他病毒也有研究，如Pule等[16]報道了嘗試使用EB病毒轉化第一代CAR-T細胞，取得了一定的療效。溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)作為載體的研究目前已取得了可喜的進展，這得益于溶瘤病毒能選擇性感染腫瘤細胞，并在其中復制且殺傷腫瘤細胞，但不會傷及健康組織。改造的T細胞裝載OV可能是一種能提高療效的新的聯合療法[17]。就病毒載體的安全性而言，研究表明在小鼠和人T細胞中，CAR-T細胞負載低劑量病毒不會影響受體的表達和功能[18-19],但仍需更長時間觀察病毒載體是否會帶來有害的插入性突變。

與病毒載體相比，質粒載體的構建花費較少，而且不會整合到宿主的基因組中，安全性有一定保證。但是，質粒載體的構建需要花費更多時間，如需要一個長期的體外培養和抗性篩選過程，人類對質粒載體的抗性基因的免疫反應等限制了其臨床應用研究。在物理呈遞和化學誘導方面，電穿孔技術適用性較廣，安全性較高，但效率較低的缺點較明顯[20]。分子技術層面轉染CAR-T細胞進展很快，如為體外轉錄編碼CAR的mRNA、微環DNA等都作為轉導載體進行研究，特別在第四代CAR-T細胞技術的研究中，基因工具“睡美人”(SB)轉座子系統[21-22]及Piggybac轉座子系統[23]的進展較快。

2.3 效應細胞設計研究

一個典型的CAR-T治療流程包括T細胞分離、修飾、擴增、回輸和監控，因此T細胞的獲得、改造和培養貫穿CAR-T治療的全過程。T細胞可來源于自體或者是健康異體，而自體來源限制了質量的規模化、需要一定的患者條件、增加了治療的花費和時間成本。如果采用志愿者的T細胞，需要克服異體排斥反應。因此基因編輯改造在CAR-T細胞技術中被逐步開發應用。英國研究人員運用TALEN基因編輯方法，使T細胞的2個關鍵基因失活。一個是T細胞上原有的識別基因，它的失活使得T細胞不會攻擊腫瘤細胞以外的目標，大大降低了不必要的異體免疫反應。另一個是T細胞膜蛋白基因，它的失活可以保護改造后的T細胞免遭特定藥物破壞。這種被修改了免疫特性的T細胞，針對靶點CD19成功治療了1例晚期急性淋巴白血病患兒[24]。因此，應用“基因編程”技術的異體CAR-T細胞技術可能會解決CAR-T細胞的大量生產問題。隨著對T細胞的進一步認識，將會有更多的基因編輯技術應用于T細胞改造，如TALEN基因編輯技術應用于T細胞，可敲除TCR-alpha基因(降低GVHD)、CD52基因(使細胞對alemtuzumab耐藥)和RQR8(自殺基因，可增加細胞對rituximab的敏感性)。已經設計成功的嚴格控制T細胞行為的“分子開關”的突破性成果，有望解決T細胞治療后出現嚴重不良反應的問題[7,25]。

在T細胞類型及輸注方式上，研究發現CD8+CAR-T細胞可以有效溶解腫瘤細胞，而CD4+CAR-T細胞會促進細胞因子大量產生，其中初始CD4+T細胞可產生大量IL-2來刺激CD8+T細胞[26]。CD4+T細胞與CD8+T細胞以1∶1的比例構成的混合細胞產物可完全根除Raji淋巴瘤[26]。對T細胞進行改造將是近年來效應細胞的發展方向之一[27]。另一個用于CAR免疫治療來源的T細胞是γδT細胞系列。這類T細胞識別抗原不同于包括通過αβTCR識別異基因抗原的蛋白質衍生肽，因此，γδT細胞具有較低的同種異體反應性，但是顯示出較好的抗腫瘤作用[28]。一般回輸T細胞前，需要對患者進行預處理，主要是通過調節化療延長過繼T細胞的存在時間。基于安全性考慮，凱特琳癌癥研究中心將T細胞過繼調整為化療后2天；而美國國家癌癥研究所認為低劑量化療聯合CAR-T療法對進展性B細胞淋巴瘤效果較好。目前，重組T細胞的回輸方式主要是靜脈回輸，采用腹膜或瘤體注射的研究大部分還處在試驗階段，而采用微創介入或瘤內注射的方式可使CAR-T細胞更多地進入實體瘤內部對靶細胞進行有效殺傷，可能是未來CAR-T治療實體瘤的方向之一。

嵌合抗原也不僅僅只是修飾T細胞，它還可以修飾細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)、NK等效應細胞[28]。Chu等[29]利用針對CS1靶點的CAR-NK細胞在多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的體內外實驗研究中獲得了突破性療效，而且CAR-NK細胞與CAR-T細胞治療一樣會產生IFN-γ等效應因子。NantKwest公司擁有以NK細胞治療為核心的三大技術平臺aNK、haNK和taNK。NK不表達殺傷細胞抑制性受體(killer inhibitory receptor，KIR)，進而避免其活性被靶細胞表面的MHC抑制。有研究開始探究將造血干細胞基因修飾成CAR-T的可行性，在HSCT過程中采用這種CAR-T可能尤其有利。

3 臨床應用研究

CAR-T細胞技術在難治復發急性淋巴細胞白血病，慢性淋巴細胞白血病、淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征(MDS)等血液腫瘤的治療方面已顯示出良好的潛力，已成為目前唯一有希望根治惡性血液病且不依靠allo-HSCT的新型技術，也是連接移植的重要橋梁或移植后清除殘存腫瘤細胞的重要武器。Porter等[30]采用CLT019治療晚期慢性淋巴細胞白血病患者6個月的無進展生存率達67%，持續緩解時間超過10個多月，最長的完全緩解時間達到2年。一項特異性靶向CD19分子的CAR-T細胞技術能有效治療急性B細胞性惡性腫瘤，其治療的16例患者的完全緩解率為88%，大多數患者接受CAR-T細胞技術治療以后可以繼續HSC移植[31]。CTL019在治療特定類型的難治性非霍奇金淋巴瘤方面已顯現特有的潛力。諾華公司公布了可評估的15例彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)、11例濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)成人患者接受CTL019治療3個月時的II期臨床研究數據。結果表明，r/rDLBCL患者組的總緩解率為47%(n=7/15)，FL患者組的總緩解率為73%(n=8/11)[32]。部分已發表的研究分析顯示，骨髓有明顯腫瘤浸潤的惡性血液病患者更易獲得緩解[30]。研究發現，l例中樞神經系統白血病(CNS-L)患者經CAR-T治療后，腦脊液中的白血病細胞得到有效清除[33]。研究顯示[34-35]，輸注的CAR-T細胞可以在患者外周血和骨髓中大量存活，有效清除功能可維持6個月以上，且部分CAR-T細胞以記憶效應細胞的形式存在。CAR-T細胞有可能為治療CNS-L、原發性CNS-L以及腦腫瘤提供新的治療方向。

實體瘤研究也取得了部分令人欣喜的成績。研究發現，針對間皮素(mesothelin)蛋白設計的CAR-T細胞技術治療胰腺癌動物的平均生存期96天，較對照組平均生存期54天提高了78%[36]。間皮素也在三陰性乳腺癌和肺癌中高表達，CAR-T細胞技術在這2個領域中的應用正在探索中。在2015年美國臨床腫瘤學會年會上，公布了CAR-T細胞技術首次在實體瘤胰腺癌治療上的突破，6例受試者中有1例轉移灶部分消失，4例腫瘤代謝趨于穩定或降低，并且發現相應的CAR-T細胞已經轉移到患者腫瘤部位[37]。一項針對19例復發或轉移的Her-2陽性肉瘤患者采用HER2-CAR T細胞治療的I/II臨床試驗顯示[38]，CAR-T治療實體肉瘤后細胞存活超過6周且無明顯毒性反應，患者的中位生存期達10.3個月(5.1～29.1個月)。檢測的2例患者腫瘤組織中均檢測到CAR-T細胞。17例可評估的患者中，4例患者有3～14個月的疾病穩定期，3例患者腫瘤切除，其中1例患者觀察到腫瘤超過90%壞死的臨床病理表現。

4 毒副反應及技術缺點

4.1 細胞因子釋放綜合征

CAR-T細胞技術在臨床應用中一個最主要的不良反應是細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)，其主要原因是CAR-T細胞技術在短時間內清除很多癌細胞，產生大量的細胞因子，從而引起免疫反應。同時，T細胞大量增殖引起的細胞因子釋放，導致機體出現發熱、肌痛、低血壓、呼吸衰竭等癥狀，嚴重時危及生命[39]。有研究觀察到CRS與疾病進展程度或者腫瘤負荷相關，在高疾病負荷的患者體內，往往有較高的細胞因子釋放。總體而言，第二代和第三代CAR較容易觸動自身抗原而引起致命的CRS。嚴格按I期臨床試驗遞增方案(爬坡試驗)，起始劑量選擇較低數量的T細胞可防止速發的、嚴重的毒性反應。此外，利用IL-6受體拮抗藥物托珠單抗(tocilizumab)以及激素預防能夠緩解該癥狀[31]。應注意的是，激素沖擊會降低CAR-T的療效。

4.2 靶向/脫靶毒性

CAR方法治療相關毒性多是腫瘤相關抗原特異性T細胞“脫靶”識別了患者正常組織低表達的自身抗原所致，如B細胞血液病治療中瞄定CD19分子引起的低丙種球蛋白血癥，這也是CAR-T細胞過繼后續反應的一個間接證據[31,33]。此外，治療上仍有5%～10%的患者缺失CD19抗原，從而逃避CD19-CAR-T細胞的識別和殺傷，導致脫靶。另外，靶向Her-2的CAR-T細胞治療可導致腫瘤部位以外的其他組織或器官遭受攻擊，例如可能產生的心肺系統毒性[39]。

4.3 神經系統毒性及其他細胞毒性

CAR-T治療白血病會引起神經系統癥狀，這些癥狀具有多樣性，如譫妄、語言障礙、運動障礙、緘默癥、癲癇發作、肝性腦病等[31-32]，部分癥狀可自行消退。也有CAR-T引起機體自身免疫性疾病風險的報道。在患兒CAR-T治療中，部分研究觀察到巨噬細胞激活綜合征[39,49]。

4.4 實體瘤治療效果較差

目前最成功的CD19-CAR-T已經在惡性血液疾病中取得了不錯的效果，對于實體腫瘤的治療效果則較差。實體瘤治療的主要難點集中在：① 必須尋找實體瘤特異性抗原，不能侵害正常組織，這樣靜脈回輸CAR-T細胞后，T細胞才能歸巢到腫瘤位置。② CAR-T必須侵入實體瘤內部發揮作用，但即使進入腫瘤后，內環境中的浸潤性的調節性T細胞(Treg細胞)、腫瘤相關巨噬細胞、程序性死亡配體PD-L1高表達、抑制性細胞因子(比如白介素10、TGFβ)，可能會抑制對其進行殺傷的各類T細胞。CAR-T細胞也會高表達程序性死亡受體PD-1。最近的臨床試驗在實體瘤特別是胰腺癌和肉瘤方面取得了不錯的進展，再次證實CAR-T細胞能夠遷移到實體腫瘤及腫瘤周圍[36-38]。有研究認為改造后的T細胞還能表達次生CAR[29]，從而更有效地定位于發病部位。克服實體瘤治療效果差的臨床試驗正在進行中，針對晚期以及療效較差的實體瘤的臨床試驗有可能取得較好的進展。

4.5 其他

CAR-T需要對每例患者進行個體化治療，因此存在治療價格偏高、療效不確定和不穩定等問題[40-41]。CAR-T臨床試驗各個中心的結果不一致，標準化治療之路任重而道遠。CAR-T治療后復發也需要關注，其長期療效和安全性有待進一步研究。

5 總結及展望

CAR-T細胞技術可能是從實驗室到臨床應用最快的一項技術，極大地促進了轉化醫學的發展。相較于化療藥物和靶向藥物，CAR-T的靶向性更強，并且可以通過技術修飾達到多靶向。免疫靶向治療的多個優點有助于治療某些預后極差的罕見腫瘤。我們有理由相信，隨著未來技術的成熟、CAR組件的進一步改進以及治療成本的逐漸下降，CAR-T細胞技術很有可能成為醫院和門診的常規治療方式。而且，CAR的研究并不局限于腫瘤，在目前的難治性疾病治療瓶頸中，CAR-T細胞技術都將可能是我們攻克難治性疾病的有效武器，如抗HIV等病毒的治療研究[42]。

CAR-T細胞技術的升級換代一直在持續研發中，每一個組件的進步都可能帶來更多的臨床獲益。近年來快速發展的生物技術，也是CAR-T細胞技術成熟的推動力。隨著未來腫瘤治療的希望必然是構建在基于免疫療法的聯合治療之上的觀點的提出，相信將會有更多的生物技術投入到腫瘤免疫治療的研發中。通用型CAR-T的研發將可能解決臨床上的規模化應用問題，即采用正常第三方細胞來源的T細胞，通過敲除內源性TCR基因，排除同種異體TCR導致的移植物抗宿主病，且能進一步提高CAR-T的殺腫瘤效率[43-44]。產生雙特異性銜接分子的CAR-T(ENG-CAR-T)細胞具有更強、更持久的抗腫瘤作用[45]。多靶標CAR-T細胞技術在臨床前實驗中顯示出更強的抗瘤效應[46]。

干細胞技術的進步將進一步豐富CAR-T療法。腫瘤干細胞是腫瘤復發的根本，可以預測設計針對腫瘤干細胞的靶向治療是今后的又一重要研究方向[47]。此外，T記憶細胞的篩選將會應用更多，尤其是中央記憶性T干細胞的研究。Themeli等[48]首次利用誘導重編程干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)技術獲得靶向腫瘤細胞的T干細胞。該研究從正常外周血采集T細胞，通過逆轉錄病毒轉導法導入OCT-4、SOX2、KLF4和c-MYC，使T細胞重編程為T-iPSC;再通過慢病毒載體將編碼針對CD19的CAR的目的基因片段插入T-iPSC，進一步誘導分化為同時表達CDl9-CAR和內源性TCR的初始T細胞。