不同條件對枯草芽孢桿菌菌劑有效活菌數的影響

孫 潔 劉菊蓮 王磊剛 胡登吉

（寧夏順寶現代農業股份有限公司 寧夏·青銅峽 751600）

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）是一種好氧菌，屬于革蘭氏陽性菌，具有良好的耐酸堿、耐高溫等特性。枯草芽孢桿菌作為植物病害生防細菌之一，具有較強的防病作用，在極端的條件下，可以誘導產生抗逆性很強的內源性孢子[1]。枯草芽孢桿菌具有孢子休眠期、生殖生長期兩個生長時期，會在生長環境惡劣、營養物質缺乏等不適宜的環境下進入孢子休眠期，并形成具有極強抗逆作用，在高溫、酸堿等極性環境下亦可生存的芽孢，從而適應環境得以生存，一旦環境變得適宜生長、營養充足，芽孢會自動進入生殖生長期，芽孢重新生長為枯草芽孢桿菌[2]。

枯草芽孢桿菌可作為生物農藥投入到植物病害應用中，可以防治作物多種真菌病害[3]。能夠提高農作物抗病能力，尤其能防治根瘤病、寄生蟲、土壤線蟲病等，為細菌繁殖抑制菌提供生長環境，使病菌、蟲卵在土壤中自然地被除掉[4]。具有一定的固氮、解磷、解鉀作用，可以促使土壤中的有機質分解成腐殖質，刺激作物生長，平衡土壤pH值，調節植物根系生態環境，形成優勢菌落，防止土傳病蟲害，解除化肥、農藥及有害因子對土壤的破壞，克服連作障礙[5]。

通過對枯草芽孢桿菌進行不同條件的處理，探究影響枯草芽孢桿菌有效活菌數的因素，為微生物菌劑和生物有機肥產品的生產提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌（寧夏順寶現代農業股份有限公司研發）、巨大芽孢桿菌（外購產品）、營養瓊脂（北京奧博星生物技術有限公司）、5%NaOH水溶液、5%HCl水溶液等。

pH計、溫度計、恒溫水浴鍋、Φ90mm玻璃培養、立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS）、恒溫搖床（HNY-2102C）、恒溫培養箱（MHP-100）、凈化工作臺（JJ-CJ-2FD）等。

1.2 方法

1.2.1 滅菌水的制備：將去離子水加入1000ml三角瓶中，塞上棉花塞，用報紙包好瓶口，121℃滅菌20min，取出后冷卻備用。

1.2.2 不同pH枯草芽孢桿菌菌液的配制：分別稱取1.0g枯草芽孢桿菌菌劑加入100ml滅菌水中，加入少量滅菌的玻璃珠，用5%NaOH、5%HCl溶液將菌液 pH 分別調節至 3、5、7、9、11 五個梯度，搖勻后室溫下保存。每7日測定一次有效活菌數。

1.2.3 不同溫度處理的枯草芽孢桿菌菌液的配制：分別稱取1.0g枯草芽孢桿菌菌劑加入100ml滅菌水中，加入少量滅菌的玻璃珠搖勻，設置20℃、30℃、40℃、50℃、60℃五個溫度梯度。將菌液置于水浴中緩慢加熱，加熱至目標溫度時立即從水浴中取出，自然冷卻。室溫下靜置過夜后測定其有效活菌數。

1.2.4 培養基平板制備方法：稱取33.0g營養瓊脂，加入1000ml去離子水中，加熱攪拌溶解后分裝，于121℃滅菌20min，取出冷卻至60℃左右。將培養基倒入φ90mm的培養皿中，厚度約為3～5mm，冷卻凝固后備用。

1.2.5 有效活菌數的測定方法：取10ml均勻菌液加入滅菌后帶玻璃珠、具棉塞的500ml三角瓶中，加入90ml滅菌水，在旋轉式搖床上200r/min充分震蕩30min，即得基礎母液。用無菌刻度吸管吸取5.0ml上述母液，加入45ml無菌水，按1∶10進行系列稀釋，分別得到 1∶1×101、1∶1×102、1∶1×103、1∶1×104……稀釋的菌懸液。

每個樣品取三個連續的稀釋度，分別取不同稀釋度的菌懸液0.1ml，加到預先制備好的培養基平板上，分別用無菌涂布器涂布均勻。每個稀釋度重復3次，并以無菌水做空白對照。于37℃培養過夜，第二天以出現20～300個菌落數的平板為計數標準，統計有效活菌數目。當只有一個稀釋度，其平均菌落數在20～300個之間時，則以該稀釋度平均菌落數計算。若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在20～300個之間時，應按兩個稀釋度菌落總數之比值決定。若其比值≤2，則應計算兩者的平均數，若比值≥2則以稀釋度小的菌落平均數計算[6]。

式中：

nv—體積有效活菌數，單位為億每毫升（億/ml）；

X—菌落平均數，單位為個；

k—稀釋倍數；

V1—基礎液體積，單位為毫升（ml）；

V2—菌液加入量，單位為毫升（ml）；

V0—樣品量，單位為毫升（ml）。

1.2.6 枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的拮抗實驗：用打孔器取濾紙片，裝入玻璃瓶中，121℃滅菌20min，取出后烘干并冷卻。稱取0.1g枯草芽孢桿菌，加入100ml滅菌水中，搖勻，稱取0.1g巨大芽孢桿菌，搖勻后加入100ml滅菌水中，加入滅菌的濾紙片浸泡30min。取0.1ml均勻的枯草芽孢桿菌加入營養瓊脂培養基平板上，用無菌涂布器涂布均勻，取浸泡了巨大芽孢桿菌菌液的濾紙片，揮干水分，貼于培養基平板上，4℃擴散1h，于37℃倒置培養過夜。

1.3 數據與分析

運用MicrosoftExcel應用程序進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同pH條件對枯草芽孢桿菌有效活菌數的影響

表1 不同pH條件對枯草芽孢桿菌有效活菌數的影響（億/ml）Table.1 Effect of different pH conditions on colony-forming unit of bacillus subtilis（108CFU/ml）

由表1可以看出，pH為5時菌液中枯草芽孢桿菌含量最高，pH為3時次之，pH7、pH9低于pH3，pH為11時菌液中枯草芽孢桿菌含量最低。隨著時間的推移，pH為3、5、7、9的菌液中枯草芽孢桿菌的數量先增加，達到一定的數量后開始下降；pH為11的菌液中枯草芽孢桿菌數量先增加，達到一定數量后開始連續下降。第一天測定的有效活菌數 pH5＞pH3＞pH7＞pH9＞pH11，菌液中的枯草芽孢桿菌有效活菌數開始增長，在第14天測定時數量達到峰值，其中 pH5＞pH7＞pH3＞pH9＞pH11，之后逐漸下降并趨于穩定，28 天測定的有效活菌數 pH5＞pH7＞pH3＞pH9＞pH11，但 pH 為11時其菌液中枯草芽孢桿菌數量下降幅度較大。這說明本品種枯草芽孢桿菌在pH為3～7的條件下生長旺盛，在pH為5時有效活菌數最高。

2.2 不同溫度條件對枯草芽孢桿菌有效活菌數的影響

表2 不同溫度條件對枯草芽孢桿菌有效活菌數的影響Table.2 Effect of different temperature conditions on colony-forming unitof bacillus subtilis

由表 2可見，其有效活菌數20℃＞30℃＞40℃＞50℃＞60℃，隨著溫度的上升，有效活菌數逐漸降低，當溫度在20～40℃之間時，枯草芽孢桿菌存活率＞90%，當溫度達到60℃時，枯草芽孢桿菌存活率僅為66.67%。這說明在20～40℃范圍內本試驗所使用的枯草芽孢桿菌可以保持90%以上的活性。

2.3 枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌之間的拮抗作用

由圖1可見，培養基平板上的濾紙片周圍產生了抑菌圈，抑菌圈平均直徑為17.6cm，本試驗所用的枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌之間會產生拮抗作用，故在產品復配時，兩種菌劑不能摻混，否則會有抑制作用。

3 結論與討論

不同pH和溫度條件會對枯草芽孢桿菌產生較為明顯的作用。本研究表明，pH在3～7時枯草芽孢桿菌生長相對旺盛，其中pH為5時有效活菌數最高，這與楊峰等[6]枯草芽孢桿菌在弱酸性和中性環境中生長旺盛的結論較為接近；當溫度在20～40℃時，本試驗所使用的枯草芽孢桿菌存活率達到90%以上。另外，通過研究表明，本實驗所使用的枯草芽孢桿菌會和巨大芽孢桿菌產生拮抗作用，故二者不適合摻混。

綜上所述，本試驗所用枯草芽孢桿菌適宜生長的pH條件為3～5，適宜生長的溫度為20～40℃，同時與巨大芽孢桿菌存在拮抗作用。這對后期研發生物有機肥、復合生物有機肥及復合生物菌劑提供了一定的參考依據。