基于文獻的冠心病血瘀證相關蛋白互作模塊及miRNA-mRNA調控網絡構建＊

諶子諾，王 階，陳恒文，劉詠梅，何浩強，陳 光，楊 光，周思遠

（1. 北京中醫藥大學臨床醫學院 北京 100029；2. 中國中醫科學院廣安門醫院 北京 100053）

冠心病是我國發病率較高的心血管疾病，血瘀證是冠心病中最常見的證候，歷年來一直被科學家們關注研究。在多組學層面冠心病血瘀證研究已經取得了一些實質性的進展，學者們通過基因芯片、高通量測序等多種技術手段找到了許多差異基因表達譜，并予以生物信息學分析。但目前仍未完全明確冠心病血瘀證的發生機制，同時研究間彼此獨立，對于不同研究得到的差異結果，未建立冠心病血瘀證基因數據庫進行整合分析。本研究通過查找冠心病血瘀證基因學研究相關文獻，整合冠心病血瘀證差異基因中mRNA 和miRNA 數據，構建冠心病血瘀證關鍵蛋白的互相作用網絡。針對冠心病血瘀證核心mRNA，挖掘其生物功能與涉及的通路。繼而根據基因間調控關系，構建冠心病血瘀證相關miRNA-mRNA 調控網絡，并定位其中關鍵節點，分析核心基因的信號通路與生理病理機制，以期為研究冠心病血瘀證的發生發展過程提供新思路。

1 材料與方法

1.1 文獻檢索

從中國知網、萬方數據庫、維普數據庫、中國生物醫學文獻數據庫、Embase、PubMed 數據庫中檢索自數據庫收錄日期-2019年12月冠心病血瘀證的研究。中文搜索“（冠心病OR 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病）AND 血瘀AND 基因”，英文搜索“coronary heart disease AND blood stasis AND gene”。

①中國知網檢索式：SU=（′冠心病′+′冠狀動脈粥樣硬化性心臟病′）*′血瘀′*′基因′；②萬方數據庫檢索式：題名或關鍵詞=（（"冠心病"+"冠狀動脈粥樣硬化性心臟病"）*"血瘀"*"基因"）；③維普數據庫檢索式：M=（冠心病OR 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病）AND 血瘀AND 基因；④中國生物醫學文獻數據庫：摘要=（冠心病OR 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病）AND 血瘀AND基因；⑤Embase 檢索式：′coronary heart disease′:ti,ab,kw AND′blood stasis′:ti,ab,kw AND gene:ti,ab,kw；⑥PubMed檢索式：（coronary heart disease[Title/Abstract]AND blood stasis[Title/Abstract]）AND gene[Title/Abstract]。

1.2 文獻納入與排除

1.2.1 文獻納入標準

①納入文獻形式包括期刊論著、學位論文、會議論文及會議摘要。②納入文獻需能提供足夠的所需研究信息。③納入研究疾病為冠心病，診斷標準參考歷年醫學界發布的團體標準或指南，如1979年WHO缺血性心肌病“心絞痛”“心肌梗死”的診斷標準、2007年ACC/AHA/ACP-ASIM《慢性穩定性心絞痛診療指南》、2015年中華醫學會心血管病學分會《冠心病診斷和治療指南》等。④納入研究證型為血瘀證，診斷標準參考歷年中醫界發布的團體標準、指南或教材，如1988年王階、陳可冀制定《血瘀證診斷標準量表》、1995年《中華人民共和國中醫藥行業執行標準·中醫病證診斷療效標準》、1997年《中華人民共和國國家標準·中醫臨診療術語·證候部分》、2002年《中醫心病診斷療效標準與用藥規范》、陳可冀主編《實用血瘀證學》等。⑤納入研究樣本種族僅限人類。⑥納入研究技術為基因芯片、測序技術、qRT-PCR、免疫組化等檢測技術。⑦納入研究指標為mRNA、miRNA、血清蛋白等。

1.2.2 文獻排除標準

①排除文獻形式包括綜述、個案報道、回信書籍及社論等。②排除文獻包括無法獲取摘要或全文信息的文獻。③排除研究內容重復的文獻；不同數據庫來源，作者、題目及出版年相同的文獻按1篇統計。④排除研究類型為動物實驗、細胞實驗的文獻。⑤排除研究疾病非冠心病，證型非血瘀證的文獻。

1.3 資料提取與數據統一

將文獻資料的基本信息與基因數據運用EXCEL2010 軟件進行梳理匯總，并在GeneCards 人類基因數據庫（https://www.genecards.org/）、NCBI gene 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)、HGNC人類基因 組 數 據 庫（https://www.genenames.org/）、miRBase（http://www.mirbase.org/）4 個數據庫中檢索，將文獻中提取的差異基因統一整理為Gene symbol形式。

1.4 冠心病血瘀證關鍵蛋白互作模塊構建

利用InWeb_IM、OmniPath、BioGrid 數據庫，對所有冠心病血瘀證相關的差異mRNA 數據，構建蛋白質-蛋白質互相作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡，其中密集連接的網絡組件被分子復雜檢測（MCODE）算法所識別，提取成為關鍵蛋白互作模塊。運用整合DrugBank、UniProt、GO、KEGG 等多個權威的數據資源Metascape 在線工具（http://metascape.org）完成冠心病血瘀證相關上調mRNA 和下調mRNA 的通路富集和生物過程注釋。

1.5 冠心病血瘀證相關miRNA-mRNA 調控網絡構建

將mRNA、miRNA 統一整理為Gene symbol 形式后，利用涵蓋高通量CLIP-Seq 實驗數據（CLIP-Seq 和HITS-CLIP）和降解組實驗數據（Degradome sequencing）的starBase 數據庫搜尋micorRNA 的靶標，與文獻數據相互驗證后將靶標對導入OmicShare Tools（www.omicshare.com/tools）在線工具繪圖，構建冠心病血瘀證核心miRNA-mRNA 調控網絡。結合Webgestalt（http://www.webgestalt.org/）在線工具，針對miRNAmRNA 調控網絡中相關mRNA 運用ORA 富集方法，選擇KEGG 通路和Gene Ontology（GO）中生物學過程（Biological process，BP）、細胞組成（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）三個項目進行可視化分析。

2 文獻檢索結果

本次中外6 個數據庫共檢索出文獻458 篇，其中知網數據庫240 篇，萬方數據庫111 篇，維普數據庫59篇，中國生物醫學文獻數據庫10篇，PubMed數據庫16篇，EMBASE 數據庫22 篇。以上去除重復文獻后為274篇。通過閱讀題目與摘要進行初步篩選140篇，經下載閱讀全文進一步篩選，依據診斷標準納入病種為冠心病（含穩定型或不穩定型心絞痛、冠心病PCI 術后），納入證型為血瘀證（不含兼雜證候），最后符合納入指標的文獻15篇（表1）。

表1 納入文獻的研究基本信息

納入的15項研究中，排除數據重復的基因和依據文獻無法判斷基因趨向的mRNA，共獲得冠心病血瘀證相關66 個上調mRNA、47 個下調mRNA、55 個上調miRNA、46個下調miRNA（表2）。

3 構建關鍵蛋白互作模塊

針對文獻數據提取到冠心病血瘀證相關的mRNA，在Metascape 人類基因組中鏈接得94 個基因，使用InWeb_IM、BioGrid、OmniPath 數據庫進行蛋白質-蛋白質相互作用映射，生成的蛋白質子集與提交的基因列表需有至少一個mRNA 形成相互作用，將蛋白質互作數據與Reactome Gene Sets、Canonical Pathway、GO Biological Processes、KEGG Pathway 多個數據庫相結合，形成冠心病血瘀證差異基因相關的蛋白質互作網絡功能注釋圖（圖1）。

不同的顏色代表不同的類，每個點代表互作網絡的連接蛋白質，根據富集程度來著色，顏色越深表示該類通路富集到的基因數目越多。取2類具有代表性的MCODE 子模塊抽象出來分析（圖2），將MCODE 子模塊中蛋白質互作網絡通路中按p值劃分得3 個最佳項，針對該通路進行功能描述和注釋（表3）。

模塊1（圖標紅色）包含2 條Canonical 信號通路和1 條GO 生物過程，其中IL6、EGR1、TP53、JUN、FOS 為涉及冠心病血瘀證的5 個核心蛋白。模塊2（圖標藍色）包含2 個KEGG 信號通路和1 條GO 生物過程，彼此間交集得到4 個關鍵蛋白質CTSL、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DRB5。

使用Metascape 分別分析上調和下調的冠心病血瘀證差異mRNA，以Canonical Pathways、Reactome Gene Sets、DisGeNET、PaGenBase、CORUM、GO Biological Processes、KEGG Pathway、TRRUST 為數據庫來源，通路富集得到具有代表性的通路（表4）。

4 構建miRNA-mRNA調控網絡

依據starBase 數據庫預測冠心病血瘀證相關miRNA 的靶基因，選擇數據庫中收錄的miRNA，設置CLIP 實驗數據支持的個數≥5，要求至少有5 個測序數據支持預測的結論，選擇至少在3 個數據庫（包括PITA、RNA22、microT、miRmap、miRanda、PicTar、TargetScan）中有預測結果，以增加預測結果準確性與可信度。將檢索到的靶基因與冠心病血瘀證已知mRNA相互映射，構建miRNA-mRNA 共調控網絡。結果符合共調控條件的有24 個miRNA（10 個上調、14 個下調）和22 個mRNA（10 個上調、12 個下調），利用OmicShare Tools繪制成圖（圖3）。

表2 冠心病血瘀證已知mRNA、miRNA

圖1 蛋白質互作網絡功能注釋

將miRNA-mRNA 調控網絡中的mRNA 導入webgestalt 在線工具進行GO 和KEGG 富集分析。富集結果KEGG數據庫得到2條通路hsa05166（人T細胞白血病1型病毒感染）和hsa05167（卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染）。富集結果GO 數據庫中三個層面Biological process、Cellular component 和 Molecular function（圖4）。

由于差異基因的富集程度越高，p值越小。因此按Pvalue 數值由小到大排列，選擇排名前10 的富集項目（表5），可見冠心病血瘀證miRNA-mRNA 調控網絡涉及的核心基因有多功能細胞因子IL6，生長因子EREG，受體IL6ST 和TNFRSF12A，轉錄因子EGR1、FOS、NFIB、TP53等。

表3 冠心病血瘀證蛋白質互作功能模塊注釋

表4 顯著性富集的冠心病血瘀證差異mRNA通路

5 討論

研究梳理冠心病血瘀證差異基因的文獻研究成果，制作了冠心病血瘀證的基因數據表，構建了冠心病血瘀證關鍵蛋白互作模塊。其中核心模塊MCODE1共有7 個關鍵蛋白，除算法識別的無記錄蛋白A2M 和IL1B 外，其余均有文獻記錄，同時研究數據均提示mRNA 表達下調。探討分析MCODE1 中5 個核心蛋白的功能及作用機制如下：白介素6（Interleukin 6，IL6）主要在急性和慢性炎癥部位產生，可在血清中通過IL6 受體α誘導產生轉錄性炎癥反應。李國敏[16]研究發現IL6 單獨檢測診斷冠心病的陽性率為90.0%。早期生長反應因子1（Early growth responsive gene-1，EGR1）作為重要的核轉錄因子，可多方面調控細胞的生長、分化、發育、增殖。姚玉娟[17]研究推測EGR1 的促凋亡作用可能有廣譜性，其在心肌缺血及再灌注中都能促進凋亡。腫瘤蛋白p53（Tumor protein p53，TP53）可編碼抑癌蛋白，誘導DNA修復或代謝改變，使細胞出現周期阻滯、凋亡、衰老，有助于維持基因的穩定性，以減少突變發生。高彥霞等[18]研究推測miR-150-5p 可能通過抑制下游靶基因P53 蛋白調控Wnt信號通路誘發冠心病。

圖4 GO BP、GO MF、GO CC富集項目對比

表5 冠心病血瘀證miRNA-mRNA調控網絡核心通路

激活蛋白-1（Activator protein-l，AP-l）包括Jun、Fos、Maf 和ATF 等眾多家族成員，原癌基因Jun（Jun proto-oncogene）和Fos（Fos proto-oncogene）都是AP-l的亞基。張紹潔等[19]研究推測c-Jun 表達上調可使基質金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP-9）蛋白表達水平增高，認為抑制c-Jun 活性可能有助于維持動脈粥樣硬化中斑塊穩定。李政等[20]研究發現心肌c-fos 基因在冠心病嚴重心肌缺血或缺血再灌注時異常表達，正常情況下很少或幾乎不表達。AP-1 可通過影響細胞（如炎癥、內皮細胞等）的增殖與凋亡[21]，參與許多心血管病的發展過程，而AP-l的下游則涉及大量的增殖、分化、死亡、生存相關基囚，如p53、p21、GM-CSF等。

在冠心病血瘀證相關的蛋白質互作核心模塊MCODE2 中，4 個關鍵蛋白都是文獻的標志蛋白，分析研究數據發現其mRNA 表達均呈上調趨勢。探討MCODE2 中4 個核心蛋白的功能及作用機制如下：組織蛋白酶L（Cathepsin L，CTSL），其mRNA 表達上調多出現于如炎癥因子、病原微生物、氧化應激等各種原因導致細胞損傷時。HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLADRB5 為 人 白 細 胞 抗 原（Human leukocyte antigen，HLA）的Ⅱ類抗原，均受控于HLA-D 區。現代研究發現許多疾病與某些HLA 等位基因相關，如黃立娟等人[22]發現黑龍江漢族人的冠心病與HLA-DRB1 中的DR1、DR4 等位基因顯著相關。Xiong Yujuan 等人[23]研究發現HLA-DQB1*03:01:01G 和DQB1*05:03:01G 與南方漢人的冠心病發病呈負相關。

同時，將納入基因數據按基因上、下調方向分別分析差異mRNA 的核心通路與病理作用機制。結果發現冠心病血瘀證中上調mRNA 的GO 生物過程分析主要與細胞分泌和免疫代謝等相關，下調mRNA 的GO 生物過程分析主要與T 細胞分化、核減數分裂、促進吞噬作用、血小板激活、生成趨化因子等相關。KEGG 通路富集分析顯示冠心病血瘀證中上調的mRNA 與造血細胞分化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化等相關。Reactome 數據庫富集提示冠心病血瘀證中上調的mRNA 與血管壁的細胞表面相互作用有關，受損血管壁上的血小板可粘附白細胞，損傷促進血小板和白細胞與內皮發生一些關鍵的相互作用。

依據starBase 數據庫和OmicShare Tools 構建冠心病血瘀證相關miRNA-mRNA 調控網絡（圖3），可見miRNA 中hsa-miR-106b-5p 與hsa-miR-20a-5p 關 聯的mRNA 最多，為關鍵調控基因。mRNA 中NFIB、RNF217、EREG、ADRB1 關聯的miRNA 最多，為核心調控基因。其中，核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）常以核因子I/B（Nuclear factor I/B，NFIB）形式存在于單核細胞、淋巴細胞、內皮細胞和平滑肌細胞胞漿內，可調控如炎癥和免疫反應等多基因的表達，如楊戈等[8]研究發現NFIB 在冠心病心絞痛患者中被明顯激活，許永紅[24]研究也提示冠心病患者的病變程度越嚴重其NF-κB水平越高。

環指蛋白217（Ring finger protein 217，RNF217）是泛素蛋白質連接酶家族的成員，在凋亡信號傳導中起作用，可通過C 端環指基序與HAX1 抗凋亡蛋白相互作用。表皮調節素（Epiregulin，EREG）參與炎癥、傷口愈合、卵母細胞成熟、細胞增殖等多種生物學過程，郝明輝等研究發現急性ST 段抬高型心肌梗死患者血清EREG 水平較高提示預后不良[25]。腎上腺素能受體1（Adrenoceptor beta 1，ADRB1）在調節血壓、心率、心肌收縮等方面十分重要，可介導去甲腎上腺素和腎上腺素的生理作用，是心肌細胞上分布最多的β腎上腺素能受體亞型。邵夢嬌等發現ADRB1 可以通過改變離子通道特性造成心房肌電重構[26]。功能注釋并分析miRNA-mRNA 調控網絡中的mRNA，可知調控網絡的mRNA 生物過程（GO BP）主要與生物調節、代謝過程、多細胞生物過程、發育歷程、對刺激的反應相關（圖4）；其細胞組成（GO CC）主要與腔上包膜、細胞膜、蛋白質復合體、核、內膜體系相關；其分子功能（GO MF）主要與蛋白質結合、核酸結合、離子結合、分子轉導活性、轉移酶活性相關。冠心病血瘀證富集核心通路主要與炎癥和免疫反應、病毒感染、細胞分化、RNA 轉錄相關（表5）。

同時，運用starBase 數據庫構建得到miRNAmRNA 調控網絡的關鍵節點，其中有10個核心miRNA與納入文獻資料中虞桂[10]和張月娟[13]的研究結果吻合。張月娟研究發現miR-106b-5p 與細胞凋亡相關，miR-223-3p 和miR-24-3p 與血小板富集相關，其中miR-223-3p 還與血管內炎癥有關。該研究構建了以miR-106b-5p、miR-20a-5p、miR-19b-3p、miR-223-3p、miR-24-3p 為核心的冠心病血瘀證miRNA-靶基因調控網絡，以miR-130a-3p、miR-15b-5p、miR-24-3p、miR-106b-5p、miR-144-3p 為 核 心 的miRNApathway調控網絡，所涉及到8個miRNA均錄屬本研究miRNA-mRNA 調控網絡的關鍵節點。虞桂研究發現上調的miR-199a-5p 和miR-146b-5p 可能通過下調TP53 和CALR 以減輕炎癥和凋亡，此觀點與本研究結果不完全相同。雖然與其所得核心miRNA 相同，但映射到的mRNA 不同。原因可能由于本研究在篩選時設置要求starBase中至少5個測序數據支持結論，并且3 個及以上數據庫（含PITA、RNA22、microT、miRmap、miRanda、PicTar、TargetScan）中可得到相同結果，以增加結果準確性。而miR-199a-5p 和miR-146b-5p 在分別檢索時僅PITA 數據庫結果支持靶標為TP53 和CALR，在其他6 個數據庫中無相同結論，不符合本研究的篩選條件，故未予納入。由此，本研究最終通過數據庫映射，推測上調的miR-199a-5p 可使CTSL 上調、ARHGEF10 下調，上調的miR-146b-5p 可使FZD1上調。卷曲蛋白受體1（Frizzled class receptor 1，FZD1）是典型Wnt 信號通路的跨膜受體，有研究發現FZD1上調在缺氧處理的新生大鼠心肌細胞中顯著可見，而沉默FZD1 可明顯抑制缺氧誘導的心肌肥厚[23]。也有研究發現鳥嘌呤核苷酸交換因子10（Rho guanine nucleotide exchange factor 10，ARHGEF10）缺乏會抑制血小板功能和動脈血栓形成[24]，從而影響冠心病動脈粥樣硬化的發生發展。由此可見，較以往的研究，本研究通過豐富的基因數據庫、嚴苛的篩選條件及研究間的數據互通，構建了新的調控網絡，可能為今后冠心病血瘀證的調控機制研究提供參考思路。

綜上，本次研究整理出了許多冠心病血瘀證標志基因（113 個差異mRNA 和101 個差異miRNA），分析差異mRNA/蛋白質間的功能通路和互作關系，獲得了冠心病血瘀證相關的蛋白互作網絡功能注釋圖（圖1）和2組關鍵蛋白互作模塊（圖2），探討其差異基因的功能通路發現主要與炎癥和免疫反應、凝血功能、細胞分化與凋亡等相關。研究豐富了冠心病血瘀證miRNA-mRNA 調控對，包含24 個miRNA（10 個上調、14 個下調）和22 個mRNA（10 個上調、22 個下調），對于進一步開展ceRNA 研究可能有一定的指導意義。同時本研究也存在一定局限性，研究設計時擬納入lncRNA，但獲取的lncRNA 數據在starBase 數據庫lncRNA-mRNA、lncRNA-miRNA 預測時，結果無法與文獻miRNA、mRNA 數據重合。原因可能由于現有研究資料中lncRNA 數據較少，無法用多個測序數據支持相同的結論，且部分文獻資料僅提供關鍵節點或特異性較高的基因，使數據獲取不全面所致。上述探析結果可能為冠心病血瘀證的生物學基礎研究帶來一些參考性的啟發，研究得到的冠心病血瘀證miRNAmRNA 調控網絡及蛋白互作機制，仍需進一步的采用基因沉默或過表達方法進行實驗驗證，更詳細的生物機理與疾病發生機制有待進行大量的后續研究。