微纖維相關(guān)蛋白2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對(duì)病人預(yù)后的影響

譚婉燕 李凝旭

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。有數(shù)據(jù)顯示，2018年全世界CRC的新發(fā)病例超過(guò)180萬(wàn)，死亡人數(shù)約為88.1萬(wàn)，分別高居所有惡性腫瘤的第3位和第2位[2]。目前研究證實(shí)，CRC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因的多階段、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，原癌基因的激活和抑癌基因的失調(diào)在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。微纖維相關(guān)蛋白2(microfibril-associated protein 2，MFAP2)作為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其可與原纖維蛋白相互作用以調(diào)節(jié)微纖維的功能，在肥胖癥，糖尿病和骨質(zhì)疏松癥中扮演重要角色[4]。近年來(lái)，MFAP2在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸引起人們的重視。有研究表明，MFAP2在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤和胃癌中顯著上調(diào)，發(fā)揮促癌基因的功能，參與腫瘤細(xì)胞的各種生命活動(dòng)[5-7]。本研究旨在檢測(cè)MFAP2在CRC細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況，并分析其與CRC病人臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

一 、對(duì)象

2013年1月～2014年4月我院住院并接受手術(shù)治療的CRC病人組織標(biāo)本65例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放化療；病理檢查證實(shí)為CRC；臨床資料完整，具有5年隨訪資料。男性38例，女性27例，年齡36～74歲，平均年齡(60.21±10.14)歲，根據(jù)第7版國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期6例，Ⅱ期28例，Ⅲ期31例。術(shù)中收取組織標(biāo)本包括癌及其配對(duì)的癌旁組織(距離癌組織5 cm以上)，所有標(biāo)本分成兩份：一份放入液氮并迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存用于總RNA的提取；另一份放入10%的福爾馬林溶液中固定用于免疫組化切片染色。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有病人均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1.主要試劑與儀器：主要試劑：胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)，鼠抗人MFAP2多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)。引物由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，MFAP2基因上游引物：5＇-CCCAAGCTTGTGAGGAACAGTACCCGT-3＇，下游引物：5＇-CGGAATTCGATACTCCCCCAACCCGA-3＇；GAPDH基因上游引物：5＇-GCACCACCAACTGCTTAGCA-3＇，下游引物：5＇-GTCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3＇。主要儀器：組織切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，漂烘片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司)，低溫離心機(jī)(賽默飛世爾公司)，微量加樣器(德國(guó)Eppendorf公司)，免疫印跡(Western-blot)電泳儀(美國(guó)Bio-rad公司)，ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HCT116，SW480)及正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞(NCM460)均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，2～3天傳代1次。

3.實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)：Trizol法提取細(xì)胞及組織中RNA，-80℃冰箱保存。取1 μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，加入SYBR green染料(Qiagen)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性30秒，之后95℃ 5秒，60℃ 30秒，共40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行溶解曲線檢測(cè)，數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法。

4.Western blot：細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，吸棄上清液，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。配制10%分離膠和5%濃縮膠，電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，置于鼠抗人MFAP2抗體(1∶3000稀釋)或鼠抗人GAPDH(1∶1000稀釋)中4℃孵育過(guò)夜孵育結(jié)束后，洗膜，再滴加兔抗鼠二抗室溫?fù)u床孵育1小時(shí)，再洗滌。將洗滌千凈的PVDF膜置于ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)儀器中掃膜，用Image Lab軟件系處理圖像即得到最終結(jié)果。

5.免疫組織化學(xué)染色：采用免疫組化SP法對(duì)切片進(jìn)行染色。具體操作如下：取4 μm厚組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，3% H2O2去離子水(無(wú)色液體)孵育10～30分鐘，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。山羊血清封閉15～30分鐘，孵MFAP2一抗(1∶100稀釋)，37℃孵育2～3小時(shí)，次日滴加標(biāo)記有HRP的二抗室溫孵育30分鐘，顯色劑顯色(DAB)，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。蘇木素復(fù)染，逐級(jí)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片染色，然后使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行閱片和結(jié)果判定。每張切片由2位資深病理專(zhuān)家讀片，于400倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，根據(jù)每個(gè)高倍鏡視野中細(xì)胞的染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分，染色評(píng)分值計(jì)算為強(qiáng)度染色(0：陰性，1：弱，2：中度，3：強(qiáng))乘以陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的百分比(1：1%～25%；2：26%～50%；3：51%～75%；4：≥76%)，總分≤3分為低表達(dá)，3分為高表達(dá)。

6.隨訪：采取門(mén)診復(fù)查或電話隨訪方式進(jìn)行，隨訪時(shí)間截止至2019年5月，納入的65例病人均完成5年隨訪。觀察指標(biāo)為總生存期(overall survival，OS)，定義為從明確診斷為結(jié)直腸癌開(kāi)始至因任何原因?qū)е虏∪怂劳龅臅r(shí)間。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1.MFAP2在結(jié)直腸細(xì)胞和組織中的表達(dá)：RT-qPCR結(jié)果顯示，CRC細(xì)胞中MFAP2 mRNA的表達(dá)水平高于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞(P< 0.05)(圖1A)；Western blot結(jié)果表明，CRC細(xì)胞中MFAP2蛋白的表達(dá)水平高于正常細(xì)胞(圖1B)。我們進(jìn)一步驗(yàn)證了MFAP2在CRC組織及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示MFAP2 mRNA和蛋白在CRC組織中的表達(dá)水平均高于癌旁組織(P<0.05)(圖1C和1D)。

圖1 MFAP2在結(jié)直腸細(xì)胞和組織中的表達(dá)

2.MFAP2蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)：免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，MFAP2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其在癌旁組織中的表達(dá)水平高于癌組織>(圖2)。在65例CRC病人中，癌組織中高表達(dá)MFAP2蛋白39例，占60%。

3.MFAP2表達(dá)與結(jié)直腸癌病人臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1。根據(jù)免疫組化染色結(jié)果，將65例CRC病人分為高表達(dá)(39例)和低表達(dá)組(26例)，分析MFAP2表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果表明，MFAP2蛋白高表達(dá)與腫瘤的組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)侵犯及TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小及術(shù)前CEA水平無(wú)關(guān)(P>0.05)。

4.MFAP2表達(dá)與結(jié)直腸癌病人預(yù)后的關(guān)系：所有65例病人均完成隨訪，死亡34例，占所有病人的52.3%；其中，1、3、5年生存率分別為100%、76.9%、47.7%。Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果表明，MFAP2高表達(dá)病人的死亡率高于低表達(dá)病人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。進(jìn)一步的單因素分析結(jié)果顯示，組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)侵犯、TNM分期和MFAP2高表達(dá)是影響CRC病人預(yù)后的重要因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。將單因素分析有意義的臨床病理學(xué)因素納入Cox多因素回歸模型，結(jié)果顯示脈管浸潤(rùn)、TNM分期和MFAP2高表達(dá)是CRC病人的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 結(jié)直腸癌組織中MFAP2表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系(65例)

注：aP<0.05

表2 影響CRC病人生存時(shí)間的單因素分析

注：aP<0.05

表3 影響CRC病人生存時(shí)間的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

注：aP<0.05

討 論

隨著早期篩查理念的深入和包括手術(shù)、放化療及分子靶向治療等多種治療手段的發(fā)展，CRC的治療效果和臨床預(yù)后已取得明顯進(jìn)步，但病人的5年生存率仍較低[1]。目前，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致CRC病人死亡的主要原因[3]。既往研究已證實(shí)癌基因的激活在CRC的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3]。

MFAP2也稱(chēng)為微纖維相關(guān)糖蛋白1(MAGP1)，是微纖維的主要成分[4]。目前，對(duì)MFAP2作用的研究主要集中在其對(duì)原彈性蛋白沉積到微纖維上形成彈性纖維過(guò)程的調(diào)節(jié)：Fujita等[8]研究表明，MFAP2參與了人睫狀體小腦發(fā)育過(guò)程中纖維蛋白-1的細(xì)胞外沉積中過(guò)程；體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)，MFAP2缺陷的小鼠在受傷后出現(xiàn)血小板數(shù)量減少、出血時(shí)間延長(zhǎng)和頸動(dòng)脈血栓閉塞延遲，表明其在止血和血栓形成過(guò)程發(fā)揮重要作用[9]。Silveira等[5]首先通過(guò)生物信息學(xué)分析表明，MFAP2在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中顯著上調(diào)，尤其是在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中；Apostolos等研究發(fā)現(xiàn)MFAP2是與多發(fā)性骨髓瘤中NF-κB/Snail/YY1/RKIP通路最共表達(dá)的基因之一，而上述通路在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用；Wang等[7]在最近的研究中證實(shí)，MFAP2在胃癌組織中過(guò)表達(dá)，且其過(guò)表達(dá)與胃癌病人無(wú)病生存期和總生存期顯著相關(guān)。

在本研究中，我們分析了MFAP2在CRC細(xì)胞及組織中的表達(dá)水平及其與65例CRC病人臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果表明，MFAP2在CRC中表達(dá)上調(diào)，且其上調(diào)表達(dá)與多種不良臨床病理特征顯著相關(guān)，預(yù)示著病人的不良預(yù)后，提示MFAP2可能在CRC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌基因的功能。

當(dāng)前，越來(lái)越多的研究已表明腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。在既往的研究中，Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MFAP2可通過(guò)激活TGF-β/SMAD2/3信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；Zaravinos等[6]發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤中的MFAP2與NF-κB/Snail/YY1/RKIP通路共表達(dá)，NF-κB和Snail作為EMT的核心轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程中扮演關(guān)鍵角色[11]，提示MFAP2可能在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的EMT調(diào)控中具有重要作用。因此，我們推測(cè)MFAP2可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程，影響腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，從而發(fā)揮其促癌功能。

MFAP2在CRC中表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)與病人的不良臨床病理特征及不良預(yù)后密切相關(guān)，有望成為CRC病人預(yù)后評(píng)估的新標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)。