甲狀腺癌分子診斷的現狀與展望

羅定遠 歐陽能太

甲狀腺癌是內分泌系統發病率最多的惡性腫瘤[1]，我國城市地區女性甲狀腺癌發病率位居女性所有惡性腫瘤的第4位，60歲以上人群甲狀腺結節發病率為50%～70%[2]，但惡性腫瘤僅占甲狀腺結節中的5%～10%。盡管傳統診斷方式，如超聲、細針穿刺(FNA)等手段能夠篩選出大多數甲狀腺癌，但是準確性有待提高，如按TBS診斷系統細胞病理還存在較高比例的不確定類型。另外，甲狀腺癌的生物學行為在細胞病理層面很難作出具有臨床意義的判斷。

甲狀腺癌分為分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer，DTC)、甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid cancer，MTC)、低分化甲狀腺癌(poorly differentiated thyroid cancer，PDTC)和未分化癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)，DTC包括甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)和甲狀腺濾泡癌(follicular thyroid cancer，FTC)。各種類型的甲狀腺癌惡性程度不同，治療方式和預后也不一樣。DTC臨床上最常見，約占90%，一般預后較好，但是也有部分DTC早期已出現局部器官侵犯、頸部淋巴結轉移或遠處器官轉移，嚴重影響病人生存期和術后生活質量[3]。因此，如何精準甄別甲狀腺結節的良惡性和評估腫瘤惡性程度具有重要的臨床意義。隨著甲狀腺癌分子機制研究的深入，從甲狀腺癌生物學行為的角度，特別是從基因變異層面認識甲狀腺癌的本質，分辨低風險甲狀腺癌和高風險甲狀腺癌已成為可能，這將進一步提升甲狀腺癌的精準診斷和治療。

一、甲狀腺癌的基因變異

甲狀腺癌發生、發展是多基因調控的結果，轉錄和轉錄后調控起主導作用，主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路及磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT信號等通路激活。其中BRAF、TERT、RAS、RET、PAX8/PPARγ和TP53等基因與甲狀腺癌診斷、侵襲性、靶向治療和預后相關性較為密切。

1.BRAF：BRAF是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，屬于RAF蛋白家族，能激活MAPK通路，與細胞的生長、增殖、凋亡、分化密切相關。BRAF位于7q34，其中15號外顯子突變占約89%，11號外顯子突變約占11%；2003年首次在甲狀腺癌中發現BRAF V600E點突變，此位點突變在甲狀腺癌中的發生率最高，引起第600位谷氨酸取代纈氨酸的錯義突變，導致MAPK信號通路持續激活。另外，599和601位點突變、BRAF基因易位等變異文獻也有報道。PTC中BRAF突變率各研究報道不一，約48%～80%，但在甲狀腺良性結節中未發現[4]。在亞洲群人中，BRAF突變頻率可能還更高一些[5]。Meta分析顯示，BRAF V600E突變的腫瘤不僅明顯出現包膜外浸潤、淋巴結轉移和高臨床分期，而且也顯示病人的復發率較高和預后相對較差，如BRAF V600E突變的甲狀腺癌出現中央區淋巴結轉移發生率為46%，故認為其可作為判斷中央區淋巴結是否轉移的獨立預測因子[6]。

2.RAS：RAS基因編碼p21蛋白，位于細胞內膜面，具有GTP酶活性，參與細胞增殖信號傳導調控系統。RAS熱點突變位于2號外顯子(密碼子12及13)，3號外顯子(密碼子61)，其中密碼子12的點突變最為常見。在機制上，激活的RAS綁定GTP，從而具有GTP激活活性，使GTP轉換成GDP，突變RAS失去GTP激活活性，導致RAS組成性激活。突變的RAS能夠激活MAPK和PI3K/AKT兩條通路，特別是以后者為主，并且RAS主要是在甲狀腺濾泡癌的增殖和轉移中起主導作用。RAS有3種亞型：HRAS、KRAS和NRAS，在甲狀腺癌中突變最多的是NRAS，并主要與濾泡癌復發及預后不良相關[7]。

3.端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)：TERT啟動子是酶調節的主要靶點，TERT啟動子突變產生一個新的ETS轉錄因子家族結合位點，上調TERT轉錄，熱點突變位于基因轉錄起始上游的-124bp(C228T)和-146bp(C250T)，PTC中突變率為5%～15%、FTC為10%～35%、PDTC為20%～50%、ATC為30%～75%。TERT啟動子突變與甲狀腺癌的惡性程度密切相關，與BRAF突變具有協同作用，增加甲狀腺腫瘤的侵襲性[8]。

4.RET：RET屬于原癌基因，編碼細胞膜受體酪氨酸激酶，RET與PTC基因融合會激活RET，進而激活MAPK和PI3K/AKT通路。目前研究顯示相關的基因融合形式有10種以上，其中RET/PTC1 和 RET/PTC3最為常見。DTC中有RET/PTC1和RET/PTC3兩種基因融合，約占80%，其中RET/PTC3往往與電離輻射引起的濾泡亞型PTC相關。伴有RET/PTC基因融合的DTC增加EGFR表達和磷酸化，常常出現更多的區域淋巴結轉移。此外，50% MTC伴有RET基因點突變，尤其是密碼子918位點的突變，約98%的MEN2A病人存在RET基因胚系突變[9-10]。

5.PAX8/PPARγ：PAX8和PPARγ基因的重排發生在2號染色體q13和3號染色體p25之間，導致PAX8和PPARγ基因融合，PAX8/PPARγ融合能夠使野生型PPARγ抑制因子的作用失活，同時也能使某些PAX8應答基因激活。這種基因易位在FTC中發生率約為30%～60%，FVPTC約38%。PPARγ基因突變與FTC、非典型甲狀腺濾泡腺瘤等有關。在PTC中，PAX8/PPARγ融合僅見于濾泡亞型，且與多灶性及血管侵襲相關[10-11]。

6.TP53：TP53基因含11個外顯子和10個內含子，編碼p53蛋白，監控細胞周期DNA損傷、調控細胞增殖、維持細胞正常生長和抑制惡性細胞增殖。TP53基因突變多發于5～9號外顯子，在各種侵襲型較強的甲乳癌亞型中常見，如甲狀腺乳頭狀癌柱狀細胞-高細胞亞型等，而在正常甲狀腺組織以及甲狀腺濾泡腺瘤、慢性甲狀腺炎等良性病變中通常不能檢出突變型p53蛋白[4]。因此，目前認為TP53基因與甲狀腺癌的發生和去分化有關，提示預后不良。

二、甲狀腺癌分子診斷臨床應用的現狀

明確診斷是腫瘤治療的前提，超聲及超聲引導下FNA是甲狀腺結節良惡性甄別的首選方法[2，12]。2017 版Bethesda報告系統將細胞學診斷結果分為6個等級[13]，分別為I類-標本無法診斷、Ⅱ類-良性病變、Ⅲ類-意義不明確的細胞不典型病變/濾泡性病變(AUS/FLUS)、Ⅳ類-濾泡性腫瘤/可疑濾泡性腫瘤(FN/SFN)、Ⅴ類-可疑惡性腫瘤和Ⅵ類-惡性腫瘤。其中Ⅲ類惡性風險10%～30%，IV類惡性風險25%～40%。細胞病理診斷的局限性就是存在較大比例的不確定類診斷，對這些良惡性不確定類型進行更進一步的判斷顯得特別重要。

近年分子檢測已廣泛應用于臨床，目前國際比較知名的甲狀腺基因檢測產品主要有4個，分別是Afirma，ThyGenX/ThyraMIR，ThyroSeq以及RosettaGX Reveal。Afirma用的是基因芯片，稱基因表達分類器(Gene Expression Classifier，GEC)，檢測167個基因的mRNA表達水平，其中25個基因用于排除濾髓樣癌、轉移癌、甲狀旁腺組織等，142個基因mRNA用于良惡性判斷，敏感性約90%，特異性約52%，陽性預測值(positive predictive value，PPV)約37%，陰性預測值(negative predictive value，NPV)約94%[14]。ThyGenX/ThyraMIR應用兩種檢測技術，先以二代測序檢測5個基因突變和3個基因融合，接著用熒光定量PCR方法檢測10個miRNA表達，最后判斷良惡性，其敏感性為89%，特異性為85%，PPV為74%，NPV為94%，在特異性、PPV和NPV上均比Afirma GEC高[15]。第3個產品是ThyroSeq，ThyroSeq V3版在V2版的基礎上增加到112個基因，不僅檢測基因點突變、融合，還增加了拷貝數變異檢測，對于以基因拷貝數改變為特征的腫瘤如Hurthle細胞癌診斷和預測提高了檢測的特異性和敏感性[7]。RosettaGX Reveal主要檢測miRNA，以24個miRNA作為良惡性分類指標，敏感性為85%，特異性為72%，PPV為59%，NPV為91%[16]。雖然在陽性預測值上各個產品的判斷標準可能不同，但總體看，以二代測序為基礎的檢測似乎有更好的應用價值。國內也有多家企業在研發或銷售類似產品，相信會有更多的國內臨床數據會陸續報道。

三、基因變異與甲狀腺癌個體化管理

目前細胞病理學診斷不足以準確評估甲狀腺癌的低危/高危狀態，分子檢測評估甲狀腺癌生物學行的研究精尖發展，有望成為甲狀腺癌惡性風險分層重要的新指標，為精準的個體化管理提供重要支持。

1.基因變異與積極觀察： Ito等[17]觀察340例PTMC，隨訪5年腫瘤直徑增大3 mm和頸部淋巴轉移的病例分別占6.4%、1.4%，10年占15.9%、3.4%，這說明有一部分PTMC病人可以臨床積極觀察(active surveillance，AS)，以及等待頸部淋巴結出現轉移仍可以手術切除治愈，且無明顯并發癥；韓國多中心隨訪370例PTMC，中位隨訪32.5個月，3.5%出現腫瘤最大直徑增加，23.2%出現腫瘤體積增大，在2、3、4、5年體積增加率分別為6.9%、17.3%、28.2%、36.2%，年齡<45歲病人的體積增加率明顯多于年齡較大者；其中，隨訪的過程中，58例(15.7%)病人由于焦慮(37.9%)、腫瘤體積增大(32.8%)和中央區淋巴結轉移(8.6%)，實施了手術治療；研究結果顯示，很大一部分PTMC病人積極觀察的過程中出現生長的現象，腫瘤體積改變是評估腫瘤生長的敏感方式；積極觀察應密切觀察中應用，對于年輕的病人來說，盡管不是積極觀察的禁忌，但是對于年輕人的應用要慎重[18]；2015ATA指南對于低危PTMC也提出積極觀察這一概念，認為積極觀察可以作為低危甲狀腺癌一種管理方式，但需要更多證據支持[12]。但這些研究僅僅涉及臨床觀察，并沒有探討BRAF、TERT等變異與甲狀腺腫瘤進展變化，同時由于病例選擇偏差、人群分布等差異，研究結果需要進一步的證據。

2.基因變異與個體化手術方案制定：外科手術是甲狀腺癌治療的主要方式，而對于部分DTC，是選擇腺葉切除還是全切除、是否預防性中央區淋巴結清掃術還存在爭議[12]；BRAF V600E 和TERT啟動子雙突變在原發性和轉移性PTC中都有報道，在原發性PTC發生率為7.7%，雙突變協同效應預測惡性程度高，與單基因BRAF V600E或TERT突變相比，經過15年隨訪，雙基因突變復發率明顯升高、死亡率高。研究發現，RAS和TERT突變也具有協同作用，雙基因突變與FTC復發、死亡率升高相關[19]；伴有BRAF/RAS合并TERT啟動子突變病人，甲狀腺全切除顯著減少術后復發風險、淋巴轉移和遠處轉移；2015版ATA指南指出[12]，BRAF突變聯合其他基因突變，如TERT、PIK3CA、TP53等基因預示甲狀腺癌具有更高的惡性風險，擴大手術范圍使病人有更多獲益。

3.基因變異與碘治療：BRAF突變病人出現碘抵抗、放射碘劑量明顯高于野生型；BARF突變下調碘代謝相關基因，如NIS、TSHR、SLC26A4、TPO和TG等相關基因，誘導BRAF基因突變能夠下調這些基因表達，抑制BRAF突變可以恢復這些基因的表達；BRAF突變上調促癌基因VEGF和MET表達，與腫瘤的侵襲能力和碘治療失敗密切相關[20]；RAS和TERT突變腫瘤病人行甲狀腺全切除和同位素治療使病人有更多獲益。在碘難治PTC中，應用MAPK通路抑制劑能恢復甲狀腺癌對放射碘的敏感性；最近研究顯示，TERT啟動子突變也與甲狀腺癌吸碘或碘抵抗密切相關；年輕PTC病人對碘治療敏感、治療效果好，這通常與BRAF突變率低和TERT啟動子突變少見有關[19]。BRAF突變與碘抵抗、淋巴結復發密切相關，BRAF聯合TERT啟動子雙突變推薦行頸部淋巴結的預防性清掃提高治愈率，因為此病例對放射碘不敏感，同位素治療效果差。在臨床實踐中，伴BRAF突變的病人并非完全不吸收碘，病人通常對碘治療部分敏感，增加放射碘劑量和應用BRAF抑制劑通常能增加治療效果。

4.基因變異與靶向治療：靶向用藥是放射碘治療抵抗或手術不能切除的甲狀腺癌病人具有廣闊應用前景的治療方式。靶向藥物主要針對VEGF、MAPK及PI3K等通路。索拉菲尼是一種同時靶向VEGFR、 RET/PTC及 BRAF等的小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，2013年FDA就已批準索拉菲尼為治療局部復發或者轉移、放射碘抵抗的進展期DTC。最近一項關于索拉菲尼對 DTC、MTC及 ATC療效的系統回顧研究表明，部分緩解率和穩定率分別是 21%和60%[21]。凡德他尼屬于口服TKI，靶點為VEGFR-1、VEGFR-2和RET，2011年凡德他尼成為第一個被FDA批準治療癥狀性或進展性MTC靶向藥物。在一個包括331例受試對象的Ⅲ期隨機對照臨床研究中，凡德他尼治療組病人的反應率高、降鈣素和癌胚蛋白下降，無進展生存期明顯延長和病人死亡率降低[22]?？ú┨婺崾橇硪环N口服TKI，作用 VEGFR-1、 VEGFR-2、 MET 和 RET靶點，2012年也被FDA批準為治療進展期MTC靶向藥物，對于治療不能切除、局部晚期或轉移性MTC效果顯著。2018年FDA批準針對NTRK1-3基因融合的靶向藥物拉羅替尼(LOXO-101)上市，成為首個被批準的針對特定基因變異，跨腫瘤種類的廣譜抗癌靶向藥。甲狀腺癌中NTRK基因融合的發生率雖然僅約1.5%，但考慮到甲狀腺癌龐大的病人基數以及不斷增長的發病率，拉羅替尼的問世仍然能為很多晚期甲狀腺癌病人帶來曙光[23]。總之，靶向藥物是難治性或晚期甲狀腺癌治療的新航標。

四、基因變異與遺傳性腫瘤

依據細胞來源不同，甲狀腺癌分非甲狀腺髓樣癌(NMTC)和甲狀腺髓樣癌(MTC)[24]。在NMTC中，家族性非甲狀腺髓樣癌(FNMTC)占5%～15%，FNMTC指來源于濾泡上皮細胞2代或2代以上直系親屬續貫性罹患甲狀腺癌，是一種雙側葉、多灶性疾病，早期出現局部浸潤、甲狀腺外浸潤和淋巴結轉移。FNMTC與TCO 19q13.2、PRN1 1q21、NMTC1 2q21位點變異有關，研究發現，這些基因變異可出現在一個或幾個家庭中。胚系突變，如ATM、RET、DNA修復基因XRCC128和XRCC329、外源性代謝基因GSTT1和GSTM1與患病風險亦相關。

MTC來源于濾泡旁細胞，家族性或遺傳性MTC占20%～25%，它可能作為MEN2綜合征的一部分或家族性MTC(FMTC)，其遺傳基礎為RET基因10q11.2位點突變。MEN2綜合征主要分為MEN2A、MEN2B和FMTC。研究發現，FMTC與RET 10q11.2基因突變有關，RET基因長60kb，包含21個外顯子。98% MEN2腫瘤突變發生在富含半胱氨酸的胞外結構域，特別是10號外顯子(密碼子609、 611、 618、 620 和 634)和11號外顯子(密碼子 630 和 634)。這些突變與95%的MEN2A和85%的FMTC有關。突變位點的不同導致致病表型也不同，包括發病年齡、MTC侵襲性、伴隨其他內分泌腫瘤是否發生和發生的時間，這決定手術時間選擇、手術方式和手術范圍[25]。

五、小結

基于基因變異對甲狀腺癌的惡性風險分層和精準個體化管理已得到廣泛認可，特別是BRAF V600E和TERT啟動子突變對于甲狀腺癌的個體化管理顯得尤為重要。BRAF V600E或RAS 和TERT 啟動子雙基因突變強烈預示DTC的高侵襲性和預后不良，對于臨床上選擇積極觀察還是外科處理、腺葉切除還是甲狀腺全切除、是否行頸部淋巴結清掃及清掃范圍、同位素治療、靶向治療等具有重要意義。隨著研究的深入，相信將會有更多的基因變異被證明可以用來指導甲狀腺癌的個體化管理。