抗松材線蟲病馬尾松體胚發生與植株再生條件優化方案探討

余雙寶

(福建省羅源縣林業局,福建 羅源 350600)

1 引言

我國針葉樹種產脂造林鄉土樹種中分布面積最廣就是馬尾松。但是近幾年發現馬尾松在生長的時候會普遍發生松材線蟲病，該病的特點是發病快、容易傳播，是一種非常有毀滅性的松樹病害，必須從根本上抵御松材線蟲病。組織培養有很多的優點：如組織培養的速度非常快、再生率非常高等，并且組織培養能夠真正的實現對馬尾松的大規模的繁殖。通過對抗性馬尾松合子胚作為實驗的材料獲得再生的植株，有可能保證本身的優良抗性，還有可能比親本抗性更強或更弱，需要一定的田間子代測試，利用測試選擇優良的，淘汰一些抗性差的。隨后對這些胚性細胞進行規模化生產和田間種植。現在有很多研究者也開始借鑒之前研究紅松的經驗來研究馬尾松。如黃健秋在研究中采用3個品種的馬尾松作為實驗的材料，建立一系列的馬尾松體胚發生的體系。但是建立的體系還存在一些問題，實驗中的再生植株率只達到7.4%，且也解決不了誘導率低和再生植株的問題。所以本研究通過分析一些抗松材線蟲病馬尾松還沒有成熟的種子，對抗性馬尾松胚性愈傷組織進行誘導和優化，建立抗性馬尾松懸浮培養T恤和抗性馬尾松體細胞胚胎發生再生體系，在研究的時候獲得了一些再生的植株，給培育抗病馬尾松做出了參考[1～3]。

2 材料和方法

2.1 外植體材料的主要來源和處理方法

在進行實驗的時候選擇的是福州市羅源縣采集出來的一些正在發育的抗性馬尾松未成熟的球果，從中最終選定4株，每株選擇6個球果，采集完成之后放在大概是4 ℃的冰箱里面保存7 d左右。在進行試驗之前要先對種子的表面進行一定的消毒處理，之后在把它們放在75%的乙醇中，放置的時間在30 s左右，之后在放進0.1%的HgCl2里面進行滅菌處理，消毒之后還需要對種子進行一定的沖洗，最后選出來的就是抗性馬尾松未成熟合子胚[4]。

2.2 生長調節劑處理抗性馬尾松胚性愈傷組織誘導率測定

在做實驗的時候使用的是抗性馬尾松和15-1家系未成熟的種子，以LP、DCR為基本的培養基，在進行進一步的篩選，在培養基里面需要放上以下幾種材料：30g/L的麥芽糖、谷氨酰胺450 mg/L,NES250 mg/L等，一共需要配置12皿，在每皿中放入3粒種子，重復進行3次左右，培養1～2個月之后觀察愈傷組織的誘導率[5，6]。計算誘導率的時候可以用以下的公式算出：

胚性愈傷組織誘導率=誘導出胚性愈傷組織的外植體的個數/接種總外值體數×100%

(1)

2.3 懸浮和固體培養下胚性愈傷組織的維持與增值測定

在測定的時候主要使用的是誘導的抗性馬尾松馬7-6家系愈傷組織為材料，之后在增殖的時候使用液體懸浮培養和固體培養兩種方法，固體培養的繼代周期為15 d左右，液體懸浮培養的繼代周期為7 d左右。在固體培養的時候要用LP為基本的培養基，之后在添加二氯苯氧乙酸和瓊脂粉等，之后在稱量剛開始的接種質量和15 d之后的愈傷組織質量。在液體培養的時候首先需要取1 g的愈傷組織作為剛開始的接種量，之后在放入液體培養中進行打散處理，培養7 d之后，在測定沉降細胞的體積。測定的方法就是把錐形瓶里面的懸浮培養細胞倒進有刻度的試管中，放置30 min之后，等細胞完全沉淀之后在讀取體積的數值[5,6]。

2.4 IBA和NAA組合處理抗性馬尾松體胚胚苗根系生長發育狀況測定

在測定的時候使用的是誘導的抗性馬尾松馬7-6家系的細胞系誘導分化出來的體胚，之后在添加一些IBA和NAA，在放在設計的培養基里面觀察50 d之后，看其體胚苗生長的狀態和生根的情況。

2.5 油菜素內酯處理抗性馬尾松體胚苗生長狀況測定

在測定的時候用抗性馬尾松馬7-6家系誘導分化出的大概1～2 cm的體胚苗作為測定的材料，在材料里面添加油菜素，之后在放到培養基里面進行培養，在培養的時候溫度需要保持在24 ℃，在40 d之后在觀察體胚的生長情況。

2.6 抗性馬尾松體胚苗的馴化和移栽

在馴化的時候需要選擇一些比較強壯的體胚苗進行，之后在煉苗，在煉苗的時候同時還需要保證溫度，適當的時候還需要撒一些水。在把馴化后的支柱進行移栽，在移栽之后需要保證育苗的溫度和濕度，之后認真照顧，在種植3個月之后統計植株的成活率。在測量植株的成活率的時候可以用以下的公式：

植株的成活率=植株成活的株數/一共移栽的株數×100%

(2)

3 實驗的結果和實驗的分析

3.1 不同生長調節劑濃度組合對胚性愈傷組織誘導的影響

表1 不同基本培養基和激素濃度對抗性馬尾松愈傷組織誘導的影響

注：外植體個數為36

通過表1分析結果發現，抗性馬尾松胚性愈傷組織誘導的最佳配比就是LP+2.0 mg/L,4-D+1.0 mg/L6-BA,這個時候的誘導率能夠達到27.8%。這種程度下就能保持穩定的增值狀態。在進行誘導的時候還發現如果在過程的時候加入一些AgNO3還能夠提高一些組織的誘導率。

3.2 懸浮和固體培養對胚性愈傷組織維持與增值的影響

通過圖1分析結果能夠發現，對于2種不同的培養條件下抗性馬尾松胚性愈傷組織細胞結構進行觀察的時候能夠知道固體培養的周期比較長，在愈傷組織的時候會比較的省時間和省精力；懸浮培養的細胞活性會更高，在大量繁殖的時候懸浮培養會更合適。

A.固體培養增殖的細胞 B.懸浮培養增殖的細胞 圖1 不同培養方式下抗性馬尾松的細胞結構

3.3 IBA與NAA濃度組合對抗性馬尾松體胚根系生長發育的影響

通過實驗結果分析能夠知道1.0 mg/LIBA+0.2 mg/LNAA是最佳的組合狀態。

3.4 油菜素內脂對抗性馬尾松體胚苗壯苗的影響

通過對實驗結果的分析能夠知道在沒添加油菜素的時候雖然也會生長但是生長的比較緩慢，加入油菜素會有助于胚苗的生長。

3.5 抗性馬尾松再生植株的移栽

在移栽的時候發現當移栽的樹苗在5 cm的時候成活率能夠達到90%，8cm的時候成活率能夠達到82.9%，所以在移栽的時候苗高在5～7 cm是最合適的移栽時機。

4 結語

通過實驗分析可知抗性馬尾松胚性愈傷組織誘導的優化的過程，在對體細胞胚增值進行增值、分化和萌發、移栽等，能夠培育出需要的再生植株。雖然在培養的時候還是會出現很多的問題，但現在已經能夠達到大量繁殖的要求。