青蒿的離體快繁技術(shù)研究

張 鳳，劉 麗，黃錦榮，蔡梅玲

(廣東省梅州市林業(yè)科學(xué)研究所，廣東 梅州 514011)

1 引言

青蒿(ArtemisiaannuaL.)又被人們稱為黃花蒿,為菊科(Compositae)蒿屬(ArtemisiaLinn)一年生草本植物[1],于花蕾期采收，割取地上部分再將其切碎并曬干，古時(shí)候?qū)⒅Q為“菣”。入藥具有清熱、涼血、退蒸、解暑、祛風(fēng)、止癢、止盜汗、防中暑等功效，用作陰虛潮熱的退熱劑。經(jīng)常用于溫邪傷陰，夜熱早涼，陰虛發(fā)熱，骨蒸勞熱，暑邪發(fā)熱，瘧疾寒熱，濕熱黃疸等病癥的治療。廣泛分布于我國(guó)各個(gè)地方、亞洲其他地區(qū)、北美洲以及歐洲東部也有生長(zhǎng)[2,3]。青蒿素是青蒿的主要活性成分，它是一種新型的倍半萜內(nèi)酯化合物，世界衛(wèi)生組織將其稱作“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”，具有起效快、效果好、毒性低的抗瘧性能[3～8]。雖然目前已經(jīng)能夠通過(guò)人工合成途徑來(lái)獲得青蒿素,但是人工合成成本太高,毒性和難度太大,還沒(méi)能投入實(shí)際生產(chǎn)。因此，田間栽培的黃花蒿是藥用青蒿素的原料來(lái)源。但是天然植物中的青蒿素含量普遍偏低,且不穩(wěn)定,又因受環(huán)境因素的影響,品質(zhì)難以控制,培育青蒿素含量高且穩(wěn)定的新品種有著明顯的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)今，以青蒿的葉片、腋芽等材料作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)與繁殖于一些報(bào)道上可見(jiàn)，但是由于對(duì)青蒿葉片、腋芽和花序的消毒條件難以把握，使得污染率較高，很難進(jìn)行規(guī)范化生產(chǎn)[ 3,9，10]。本實(shí)驗(yàn)以青蒿莖段為外植體，采用MS與不同種類、濃度激素組合的培養(yǎng)基,研究了青蒿莖段的消毒條件、叢生芽的誘導(dǎo)以及根系的生長(zhǎng)狀況,旨在通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)為青蒿的快速繁殖提供基礎(chǔ)平臺(tái)。

2 材料和方法

2.1 材料

露地栽培青蒿的帶芽嫩莖，該材料是經(jīng)測(cè)定的青蒿素含量較高的植株。

2.2 方法

2.2.1 培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件

用MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,附加蔗糖30 g/L ,瓊脂7 g/L，附以不同比例的激素，pH值為5.5～6.0,121 ℃高溫滅菌20 min 。培養(yǎng)條件為26±2 ℃，光照1500～2000 lux，每天光照12 h。

2.2.2 外植體的消毒

選取生長(zhǎng)良好的青蒿嫩莖，剪去葉片，用流水沖洗掉表面的灰塵，在無(wú)菌工作臺(tái)中先用70%乙醇浸泡30 s，再用0.1%的升汞分別消毒8 min、9 min以及10 min，然后用無(wú)菌水清洗6～8次。最后將無(wú)菌外植體切成1 cm左右的帶節(jié)莖段，將切好的無(wú)菌莖段接種到培養(yǎng)基中。每瓶接種一個(gè)外植體，每個(gè)處理接種20瓶，大約15天以后，對(duì)污染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，找出最適宜的消毒時(shí)間。

2.2.3 不定芽的誘導(dǎo)

重新選取生長(zhǎng)良好的青蒿莖段加以消毒，消毒過(guò)程中 0.1%的升汞消毒時(shí)間采用消毒效果最佳的消毒時(shí)間，消毒完成后，將無(wú)菌外植體放入配置好的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種一個(gè)外植體，每個(gè)處理接種20瓶。共設(shè)計(jì)了3種添加了IBA、6BA 的MS培養(yǎng)基，每20 d左右更換一次培養(yǎng)基。對(duì)叢生芽的生長(zhǎng)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定誘導(dǎo)效果最佳的培養(yǎng)基。

2.2.4 生根培養(yǎng)以及煉苗

共設(shè)計(jì)了3種添加了IBA、NAA的1/4 MS培養(yǎng)基,待苗長(zhǎng)至2～3 cm 時(shí),分成單株，除去基部的愈傷組織,接種于生根培養(yǎng)基中,7 d左右開(kāi)始生根,15 d后開(kāi)始煉苗，打開(kāi)瓶蓋 ,在瓶子里加入適量蒸餾水，置于室溫下2～3 d。取出小苗,洗去根部的培養(yǎng)基，移栽到事先準(zhǔn)備好的土壤中,澆透水,用塑料膜蓋3 d ,然后定期澆水及觀察，統(tǒng)計(jì)成活率可達(dá)90%以上。

3 結(jié)果與分析

3.1 外植體的消毒和不定芽的誘導(dǎo)

選取生長(zhǎng)良好的青蒿嫩莖，剪去葉片，用流水沖洗掉表面的灰塵，在無(wú)菌工作臺(tái)中先用70%乙醇溶液浸泡30 s,再用0.1%的升汞消毒8 min、9 min以及10 min。然后將無(wú)菌外植體切成1 cm左右的帶節(jié)莖段，將其接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，大約15 d以后，對(duì)污染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 0.1%的升汞不同消毒時(shí)間的消毒效果

注：標(biāo)有不同英文字母者為差異達(dá)到0.05顯著水平，下同

從表1中可以知道：不同消毒時(shí)間下污染率的差異十分明顯。隨著消毒時(shí)間的增加，污染率也逐漸降低，但是在消毒時(shí)間為10 min時(shí)，出現(xiàn)了極為嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象，不利于青蒿叢生芽的進(jìn)一步生長(zhǎng)。因此，將0.1%的升汞的消毒時(shí)間控制在9 min左右較為適宜。

利用MS與不同濃度6-BA 與IBA激素組合的培養(yǎng)基,對(duì)青蒿莖段進(jìn)行不定芽誘導(dǎo),15 d以后，對(duì)不定芽的生長(zhǎng)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以確定不定芽誘導(dǎo)效果最佳的培養(yǎng)基 (見(jiàn)表 2)。

表2 青蒿不定芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

從表2中可以看出，在IBA的濃度為0.1 mg/L、6-BA的濃度為1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L時(shí)，青蒿莖段的不定芽誘導(dǎo)率都非常高，均達(dá)到了100%。且以上3種培養(yǎng)基中皆沒(méi)有發(fā)現(xiàn)畸形苗和變異苗,由此可知青蒿不定芽繁殖遺傳穩(wěn)定性較好。1號(hào)培養(yǎng)基中芽苗呈深綠色并且生長(zhǎng)狀況良好，2號(hào)和3號(hào)培養(yǎng)基中，在莖段基部容易形成白色、疏松的愈傷組織，芽苗長(zhǎng)勢(shì)較差，并且產(chǎn)生的不定芽數(shù)量與1號(hào)培養(yǎng)基相比明顯有所下降，說(shuō)明高濃度的細(xì)胞分裂素并不利于叢生芽的生長(zhǎng)。故1號(hào)培養(yǎng)基(MS+6-BA 1 mg/L+IBA0.1 mg/L)為叢生芽的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

3.2 試驗(yàn)苗的生根

等到不定芽生長(zhǎng)至2～3 cm 時(shí),于MS+6-BA 1 mg/L+IBA0.1 mg/L培養(yǎng)基中選取生長(zhǎng)幾乎一致的芽苗切分成若干單株,除去基部的愈傷組織后轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，過(guò)一段時(shí)間以后，對(duì)生根情況進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)。

表3 青蒿的生根試驗(yàn)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:1號(hào)培養(yǎng)基中生根率較低，僅在50%左右，2號(hào)和3號(hào)培養(yǎng)基中生根率較高，均達(dá)到了90%以上。隨著IBA濃度的增加，主根數(shù)量并沒(méi)有明顯的增加，但是側(cè)根明顯更加發(fā)達(dá)，因此適當(dāng)?shù)脑黾覫BA的濃度更加有助于實(shí)驗(yàn)苗的生根。然而研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IBA濃度達(dá)到2.0 mg/L時(shí)，根系較細(xì)，而2號(hào)培養(yǎng)基(1/4MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 1.5 mg/L)的生根情況最好,生根數(shù)量多且根系粗壯,并且芽苗種植以后，存活率高達(dá)90%以上，更適用于遺傳學(xué)的研究,故此培養(yǎng)基為最佳生根培養(yǎng)基。

4 討論

近些年來(lái)，藥用植物越來(lái)越受到人們的親睞，但隨著人們對(duì)藥用植物需求的增加，野生的藥用植物，尤其是一些珍稀的藥用植物，由于一直以來(lái)受到人類毫無(wú)節(jié)制地采摘,其資源早已不可能滿足市場(chǎng)的需求。因此，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為保存這些珍稀藥用植物資源不可或缺的技術(shù)手段，許多珍稀的藥用植物已經(jīng)利用組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了資源的保存，同時(shí)使市場(chǎng)的需求得到了解決[11～14]。

本研究以青蒿幼嫩的帶芽莖段作為外植體，使用常規(guī)的培養(yǎng)基、消毒劑和植物激素，展開(kāi)了消毒、叢生芽誘導(dǎo)、生根等一系列研究。但是本實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)基組合與其它研究的略有不同，同時(shí)本研究以莖段為外植體直接進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，取材方便，容易消毒，省去了脫分化形成愈傷組織這一過(guò)程，節(jié)約了較多時(shí)間。但在研究中發(fā)現(xiàn)青蒿莖段中含有許多的酚類化合物，切芽時(shí)產(chǎn)生的創(chuàng)傷會(huì)將組織中的多酚氧化酶激活。該酶很容易被氧化為棕褐色的醌類物質(zhì)，使外植體的切口處發(fā)生褐變，并滲透到培養(yǎng)基中，致使培養(yǎng)基褐化,同時(shí)給培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和分化帶來(lái)嚴(yán)重的影響，甚至?xí)斐膳囵B(yǎng)物的死亡[15，16]。及時(shí)的轉(zhuǎn)接能夠有效防止褐變,有利于試驗(yàn)苗的健康生長(zhǎng)。

本研究還發(fā)現(xiàn)6BA和IBA結(jié)合的MS培養(yǎng)基非常利于叢生芽的誘導(dǎo)，在本研究中選用的激素濃度下，青蒿莖段叢生芽的誘導(dǎo)率全部達(dá)到了100%,但是通過(guò)比較不定芽的數(shù)量和生長(zhǎng)狀況，MS+6-BA 1mg/L+IBA0.1mg/L是誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽的最佳培養(yǎng)基。IBA和NAA結(jié)合的1/4MS培養(yǎng)基非常利于根的生成，生根率均達(dá)到了90%以上，但生根數(shù)量多且根系粗壯的NAA 0.1 mg/L+IBA 1.5 mg/L培養(yǎng)基是誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基，栽種后存活率也達(dá)到了90%以上。本研究為工廠化培育優(yōu)良無(wú)性系種苗提供了理論基礎(chǔ)和一定的材料。