關于紅霉素藥物殘留檢測的研究概況

張曉云，李培鋒*，孫華，毛偉，白玉廷，何秀玲

1. 內蒙古農業大學獸醫學院（呼和浩特 010018）；2. 農業部動物疾病臨床診療技術重點實驗室（呼和浩特 010018）

紅霉素因其具有較高的抗革蘭氏陽性菌活性作用和低毒性的特點，成為在此類化合物中首個廣泛應用在臨床上的藥物，和其他大環內酯類抗生素相比較有性質相似或更強的抗菌活性[1-2]。紅霉素在最開始是作為青霉素的替代品在臨床獸藥應用方面應用廣泛，目前紅霉素已被廣泛應用于畜禽細菌性和革蘭氏陽性菌感染的化學治療，特別是在低劑量下紅霉素有良好的促生長作用，亦成為重要的飼料添加劑來提高飼料轉換率。雖然紅霉素有良好的藥理作用，但長期代謝不良會淤積一定濃度在身體內，藥物殘留問題則對機體產生一些副作用，主要危害是引起人體的內分泌紊亂、水電解質及糖代謝異常、性早熟、致癌、致畸；紅霉素酯化物易發生，發生率高達40%，肝功能不良者禁用。同時可引起人體的過敏反應，導致人體的正常菌群失調，使致病菌產生耐藥性，誘發癌癥等。此外它會影響人體正常的激素水平，并使兒童異性化傾向、腫瘤等，使人出現諸多不適癥狀。

1 紅霉素殘留檢測情況的研究進展

目前國內外主要的檢測紅霉素的方法和技術包括：（一）能夠同時進行分離、分析，具有高效分離技術和高檢測靈敏度，對紅霉素殘留情況進行定性、定量分析的理化分析法，如（1）高效液相色譜法（HPLC），根據檢測器的不同又分為液相色譜-紫外法（LC-UV）、液相色譜-熒光法（LC-FLD）、液相色譜-蒸發光散射檢測法（LC-ELSD）、液相色譜-電化學法（HPLC-ECD）、液相色譜-二極管陣列檢測法（LC-DAD）、液相色譜-噴霧法（LCCAD）；（2）氣/質聯用法（GC-MS）；（3）液/質聯用法（LC-MS、LC-MS/MS）；（4）薄層色譜法（TLC）；（5）分子印跡固相萃取-高效液相色譜法（MISPE-HPLC）；（二）免疫分析法，如酶聯免疫分析法（ELISA）、熒光微球免疫層析法（FMCA）、膠體金免疫層析法（IGCA）；（三）生物測定法，主要有微生物檢測法等[3]。

1.1 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法因其具有分離速度快、檢測靈敏度高、自動化程度高等眾多優點，成為至今廣為使用的一種理化檢測方法，它能做到精確定性及定量檢測食品中的有毒及有害殘留物。因紅霉素僅在210 nm處呈現一定的紫外線（Ultravioletray，UV）吸收，許多內源性雜質會在210 nm處產生強烈干擾，所以通常情況下不采用紫外檢測器，大量的文獻表明測定紅霉素殘留大多選用HPLC-ECD（電化學檢測器）或柱前衍生化HPLC-FLD（熒光檢測器）。于慧娟等[4]建立了高效液相色譜-熒光法對蝦組織中紅霉素殘留量的檢測，檢出限為150 μg/kg，回收率≥75%?；菔|華等[5]建立了以高效液相色譜法測定羅非魚中紅霉素殘留量的方法，提出了以乙腈為提取劑，經過液-液萃取、固相萃取、反萃取等步驟對樣品進行分離凈化的樣品處理方法，方法檢出限為400 μg/kg。Edder等[6]采用HPLC-FLD測定肉、魚、肝、腎、蛋和奶中紅霉素的定量分析，采用羅紅霉素為內標，該方法在5～50 μg/mL范圍內線性關系良好。

1.2 氣質聯用法（GC-MS）

氣相色譜-質譜聯用檢測法實現了高效層析分離和檢測聯機，可用微電腦控制層析條件、程序和數據處理，其特異性、靈敏度和重復性均較好，可以一次性地完成同一物質中多類藥物及其代謝物的檢測。因大環內酯類藥物的特性，如分子量大，且有多數的極性基團，導致其不可直接采用氣相色譜檢測，通常需要進行復雜的衍生化過程才可以進行GC-MS分析。Takatsuki等[7]建立了GC-MS法檢測組織中紅霉素殘留的方法。前處理過程為：用甲醇提取肌肉樣品，LLE后再經硅膠固相萃取柱凈化，其目的是去除干擾性雜質，在鉑催化下加氫，后中性糖鏈在HCl的作用下水解脫去，最終水解產物生成醋酸酯，其目的是為了用來提高檢測的靈敏度。近幾年，國外考古學家考古出土的有機殘留物、有機膠料、有機涂層等的分析報道[8]，這些物質的檢測應用最多的當屬氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS），該技術對文物、有機物的分析檢測涉及的也較為全面。目前我國關于文物有機物的分析測定在氣相色譜-質譜技術方面的報道很少出現。它可實現復雜文物體系中有機物的定性及定量測定。分析過程中取樣量極少，檢出限可達ng級別，在很大程度上避免了對文物的損壞，在文物有機分析中的地位不可撼動。氣相色譜-質譜雖然優點頗多，但相對于大環內酯類藥物的性質而言，對其樣品前處理以及檢測過程都尤為繁瑣（包括一系列衍生化過程）。因此，檢測結果的準確性取決于選取怎樣高效的樣品前處理方法及色譜分離條件。對于分析物的要求：（1）良好的熱穩定性和揮發性，一般在250 ℃下可以氣化；（2）不含無機鹽、酸等對色譜固定相產生破壞或影響分析準確性的無機物。此外，使用通用型的氫火焰離子化檢測器（FID）時，檢測器無法辨認流出的組分，對復雜樣品中的共流出峰缺乏指認和定量的手段。

1.3 液質聯用法（LC-MS、LC-MS/MS）

因組織、水產品等樣品中存在許多干擾性物質，高效液相色譜檢測樣品中紅霉素的含量具有一定的局限性。而采用液質聯用法，可以分析GC-MS所不能分析的強極性、難揮發、熱不穩定的化合物。其優點為：（1）應用廣泛，對大部分的化合物幾乎都適用，在很大程度上解決了分析熱不穩定化合物的難題；（2）分離能力強，對于在色譜上沒有完全分離開的化合物，只要通過MS的特征離子質量色譜圖就可以區分各自的色譜圖來進行定性定量；（3）定性分析結果可靠，可明確每一個組分的分子量和分子的結構信息；（4）檢測限低，MS具備高靈敏度，即使在較低濃度的情況下也能夠對樣品進行很好的定性定量確認檢測；（5）分析時間快，使用的液相色譜柱為窄徑柱，大大減少了檢測時間，提高了分離效果；（6）自動化程度高，LC-MS/MS具有高度的自動化。

因液質聯用法的高靈敏度和高選擇性，對于大環內酯類這樣的高分子藥物采用LC-MS法確證是較為理想的方法，Masakazu Horie等[9]采用LC-ESI-MS法測定肉類中的8種大環內酯類抗生素殘留。Delepine等[10]研究了采用PB/LC/MS方法檢測牛肌肉中5種大環內酯類抗生素的方法，其中采用梯度洗脫的反相液相色譜-MS檢測法證明在牛肌肉中有紅霉素、螺旋霉素、泰樂霉素、替米考星和交沙霉素的殘留。

近年來LC-MS/MS聯用技術日趨成熟，該法比LC-MS定性更可靠，定量更靈敏準確。Dubois等[11]采用LC-MS/MS法測定動物組織、牛奶和雞蛋中的5種大環內酯類殘留，其回收率達到80%～110%，相對標準偏差為2%～13%。于慧娟等[12]建立了高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定水產品中紅霉素殘留量的方法，以紅霉素同位素標記物為內標，檢出限達1.0 μg/kg。張曉燕等[13]建立了高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂王漿中紅霉素及其代謝物。于慧娟等[14]建立了高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中紅霉素的殘留，包括魚、蝦、蟹、甲魚等水產品。周玲等[15]建立了高效液相色譜串聯質譜檢測巢脾中紅霉素的殘留，包括蜜蜂及蜂產品；林維宣等[16]采用液相色譜串聯質譜法檢測關于牛乳中多肽類抗生素的殘留量。

1.4 薄層色譜法（TLC）

薄層色譜法主要應用于難揮發或高溫下易變化而不適用于氣相色譜的物質。它具有分離速度快、選擇性好、顯色容易的優點，不僅適用于微量樣品（0.01 μg）的定性分析，也用于大量樣品（大于500 mg）制備。按涂布薄層固定相的性質可分為吸附薄層色譜、表面分配薄層色譜、離子交換薄層色譜和薄層電泳等。對于紅霉素來說，茴香醛-硫酸試劑遇紅霉素初期顯藍紫色，反應1 h后紅霉素呈現橄欖綠色。韓南銀等[17]建立了薄層色譜法檢測蜂蜜中紅霉素的殘留，利用固相萃取原理對蜂蜜中紅霉素進行提取，其檢測限量達到5 mg/kg。因蜂蜜組成成分復雜，前處理比較麻煩，故采用薄層色譜法檢測可以排除許多干擾因素，取得良好的檢測結果。但缺點也較明顯：①對于復雜化合物的識別能力不足，分離效果差，不能進行準確定量；②影響因素較多；③每一類藥物都包括幾種或十幾種化學結構和性質非常相似的化合物，因藥物含量甚微，對生物高分子的分離效果不甚理想，不如采用GC/MS和HPLC或LC-MS/MS靈敏；④對于紅霉素來說達不到農業部規定的檢測要求。

1.5 微生物檢測法

微生物效價法是經典的抗生素含量測定法。王敏等[18]應用微生物生長抑制原理，通過Bacillus stearothermophilus（嗜熱脂肪芽胞桿菌）細菌的生長與否，對大環內酯類藥物殘留進行定性檢測；Markakis等[19]于1996年利用微生物法定量檢測了動物飼料中紅霉素的含量；一方面根據微生物自身特點的局限性，另一方面不同生產廠家生產出來的菌種、產品的組成組分也大不相同，導致檢測結果有明顯的差別，故用該方法很難達到準確的定性定量分析的目的。這種方法在分析時間、分析成本、對目標物質的分離和確認能力、方法的定量能力上都有著明顯的不足，特別是在畜產品和食品中藥物的殘留分析領域中發揮的作用不大，因此主要用于大批樣本中抗微生物藥殘留的快速篩選。隨著抗生素類藥物的發展和分析方法的進步，理化方法逐漸取代了生物學法。

1.6 酶聯免疫分析法（ELISA）

酶聯免疫分析法是基于抗原和抗體特異性反應而建立的，該方法有兩個特點：一是抗原抗體免疫反應在固體表面進行，二是用酶作為標記物進行蛋白質測定。其中酶反應的催化效應起到放大反應效果的作用，從而提高ELISA檢測技術的靈敏度。酶聯免疫分析法已較多地應用于動物源性食品中各類抗生素殘留的定性和定量測定，在水產品抗生素殘留檢測領域也有所應用。

崔廷婷等[20]建立了酶聯免疫分析法測定豬肉、豬肝、牛肉、魚肉、蝦肉、蜂蜜和牛奶中紅霉素的方法，其檢測限分別為4.13，8.23，0.78，3.75，7.94，3.09和1.87 μg/L，樣品添加回收率范圍為69.0%～107.5%，批內變異系數為5.7%～11.4%，批間變異系數為8.7%～14.0%；與硫氰酸紅霉素的交叉反應率為114%，與琥乙紅霉素的交叉反應率為67.4%，與其他藥物的交叉反應率均小于0.1%。Albrecht等[21-22]建立了牛奶中檢測紅霉素的ELISA方法。該方法中紅霉素的LOD為10 ng/kg。韓青等[23]建立了牛奶中ERY的icELISA，檢測限為0.3 μg/L。

1.7 分子印跡固相萃取-高效液相色譜法（MISPEHPLC）

分子印跡技術，又稱分子烙印技術，是將模板分子（印跡分子、目標分子）與交聯劑在聚合物單體溶液中進行聚合得到固體介質，然后通過物理或化學方法洗脫除去介質中的模板分子，得到“印跡”有目標分子空間結構和結合位點的分子印跡聚合物（MIPS）。它具有三方面的特點：①預定性，可以根據不同的目的制備出不同的分子印跡聚合物，以滿足不同的需要；②識別性，分子印跡聚合物是根據模板分子定做的，可專一地識別印跡分子；③實用性，可以與天然的生物分子識別系統如酶與底物、抗體與抗原相比擬，但由于它是由化學合成的方法制備的，因此又有抗惡劣環境的能力?；谶@些特點，目前該方法已在如下方面得到了應用：色譜分析、固相萃取、仿生傳感器和模擬酶催化。宋彬等[24]建立了一種分子印跡固相萃取-高效液相色譜測定豬肉中紅霉素的方法，其殘留檢出限（S/N=3）為0.2 mg/kg。豬肉樣品中不同添加水平下紅霉素的加標回收率為95.2%～104.2%，相對標準偏差（RSD）小于5%。胡琪等[25]采用沉淀聚合法制備紅霉素分子印跡聚合物，考察了不同分散相對分子印跡聚合物制備及其對吸附性能的影響，并通過Scatchard模型進一步評價了聚合物的吸附特性，探究了紅霉素分子印跡聚合物在其結構類似物及實際食品樣品中常見抗生素的吸附特異性，并對牛奶和雞蛋樣品進行了加標回收試驗。實際樣品中的平均回收率為82.99%～98.09%。

1.8 熒光微球免疫層析法（FMCA）

FMCA的原理是基于抗原抗體特異性免疫反應的新型膜檢測技術。該技術以固定有檢測限（包被抗體或包被抗原）和質控線（抗抗體）的條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，熒光標記抗體或抗原固定于連接墊，通過毛細管作用使待分析物在層析條上移動。熒光微球FMs，它是一種新型的載體材料，主要是有機或無機聚合物材料，內部含有熒光物質，外部能量刺激后會發出熒光，作為特殊功能微球，形態穩定，粒徑均勻。它作為一種抗體標記示蹤物，通過與抗體偶聯，比較試紙條熒光顯色強度、跑樣背景，微球標記抗體釋放情況及檢測靈敏度，來選擇最佳顏色特征的微球。對于只具有單一抗原表位的小分子抗原紅霉素來說，待測小分子抗原與熒光標記抗體結合后，由于空間位阻作用難以再與檢測線上的包被抗體結合。所以，紅霉素多采用競爭免疫層析法檢測。Li等[26]報道了紅霉素的熒光微球免疫層析（FMCA）測定法，選擇與紅霉素結構相關的Abs為抗ERY單克隆抗體（mAb），抗原（Ag）為ERY-BSA，采用競爭免疫層析法檢測。結果表明，紅霉素在原料奶中的檢出限（LOD）為0.13 ng/mL，回收率為91.8%～109.2%，變異系數（CV）為5.4%；李向梅[27]建立了可同時檢測牛奶中紅霉素的多殘留熒光微球定性和定量免疫層析方法。該方法牛奶中紅霉素的cutoff值為2.5 μg/L。牛奶樣本簡單稀釋，同步檢測紅霉素的時間在20 min以內。通過熒光信號讀數儀分析，該方法對牛奶中紅霉素的檢測限為0.13 μg/L。紅霉素在1.25～5 μ g/L的添加水平下回收率為91.8%～109.2%，變異系數為5.4%～11.3%。但熒光微球合成的技術難度相對較大，目前國內制備的熒光微球存在粒徑不均一等現象，主要以進口為主，價格相對昂貴，熒光微球免疫試紙條在光照射、溫度、碰撞、濕度大等外界條件下容易發生熒光淬滅現象。且受基質干擾影響較大。

1.9 膠體金免疫層析法（GICA）

GICA的原理是結合了膠體金技術和免層析技術發展而來的，其本質是一種固相反應的ELISA，并用膠體金來代替底物顯色。是以膠體金作為示蹤標記物，利用抗原抗體在固相載體反應的新型免疫標記技術。實際上是蛋白等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理目前還未定論，一般認為是金顆粒表面的負電荷和蛋白質的正電荷靜電吸附，從而形成牢固的結合。其優點是檢測方法簡單而快速，數分鐘即可得出結果；不需要儀器設備，操作人員不需要特殊訓練；試劑穩定，適用于單份測定；無污染；單一試劑，一步操作，小型實驗室即有條件開發生產，干燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上。有研究報道[27]膠體金試紙條檢測牛奶中紅霉素的cut-off值為5 μg/L，檢測在10 min內完成。是一種定性或半定量的檢測方法，用于不需要精確定量檢測，但需快速得出檢測結果的分析。

免疫分析技術與常規的理化分析技術對比而言最大的優點在于易操作、分析速度快、檢測成本低。以微量滴定板的ELISA例子中看出，免疫測定法以取樣量小，前處理簡單，容量大，儀器化程度低，分析效率是HPLC或GC的幾十倍以上。免疫測定法的缺點在于確定待測物組成或結構方面的信息太少（僅為吸收度或計數），一般不具備多殘留分析能力；因其分析過程繁瑣，試驗操作過程中影響結果的因素太多，將其作為標準化方法難以實現；且研究試驗方法周期長，某些待測物的半抗原合成成本過高。故只能作為其重要補充。

1.10 固相微萃取SPME

固相微萃?。⊿olid Phase Micro-extraction，SPME）是一種適用于氣體和液體樣品的新穎的樣品前處理技術。主要包括兩個過程：（1）將涂有固定相的萃取頭插入樣品中，待測物將在固定相涂層與樣品中進行分配直至平衡；（2）將萃取頭插入分析儀器的注射口，當待測物脫附以后，可進行分離和定量檢測。巧妙地將待測物的萃取、脫附、進樣結合在了一起。而頂空固相微萃取是SPME分析方法中最推薦的一種方法，其中固相微萃取的裝置類似于注射器，在萃取頭部分有MCM-41復合介孔分子篩作為固相微萃取涂層，微萃取涂層是SPME的主要部分，在多相平衡的基礎上，依據分析物在萃取頭上與試樣之間的分配平衡而實現待測物的檢測。但由于其萃取涂層容易磨損，導致萃取涂層的使用壽命有限。SPME發展至今，已被廣泛應用到環境監測、食品檢驗等領域。徐娜[28]研究了一種固相微萃取檢測污水處理廠中大環內酯類抗生素的殘留方法，其中包括紅霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素等。其中紅霉素的方法檢出限是0.8～3.2 ng/L，回收率為99.1%～112.4%。

由于紅霉素僅在210 nm呈現紫外吸收，故紫外檢測器不能滿足殘留檢測要求，常采用熒光檢測器對其進行含量檢測，需經過柱前衍生，因FMOC-CL同羥基反應生成熒光酯，因而具有熒光性。紅霉素的衍生就是利用分子中的羥基同FMOC-CL反應生成熒光衍生物的性質來實現的，目前采用HPLC存在的問題是：①在有樣品基質的情況下目標峰有干擾峰的出現，衍生產物和副產物分不開，響應值整體偏低；②衍生產物存在時間太短，12 h后就會分解，樣品基質對衍生的影響較大，目標峰峰形較差；樣品前處理一般包括提取、凈化、濃縮、衍生四部分，前處理步驟越復雜，其干擾因素就越多，衍生產物就越不穩定，產生的誤差就越大，導致靈敏度降低，回收率低。

熒光微球免疫層析法和膠體金免疫層析法中熒光微球的合成、膠體金的制備難度較大，紅霉素藥物抗原抗體的制備過程較難，且定量不準確。

2 結語

動物性組織中藥物殘留問題引發的嚴重后果已向人類敲響了警鐘。大規模發展生態農業、生產綠色食品（肉、蛋、奶、魚、蝦）是我國畜牧業發展的最終目標。人們之所以對藥物殘留問題如此關注，歸根結底是我國對動物源性食品藥物常規檢測認識的匱乏、許多生產者不重視藥物殘留問題且不了解應如何控制藥物殘留。動物性食品的安全關系到獸藥生產者、廣大消費者、畜牧部門、畜禽飼養者及農業等，其中獸藥生產者和畜禽飼養者是最重要的，他們只要能從思想根源處認識到獸藥殘留帶來的危害，能夠安全生產動物性食品，合理用藥，選用合適的劑量療程，合理的輪換用藥，從根源上拒絕藥物殘留，這樣我們才能吃到最安全的食品，才能有效控制或避免獸藥殘留對人類健康的影響。隨著經濟飛速發展、人民生活水平的不斷提高，對動物性食品的需求量也在不斷增加，動物性食品獸藥殘留問題也逐漸成為全社會廣泛認同的公共衛生問題。獸藥殘留問題的危害不言而喻，對于人類身體康健、養殖業的健康發展乃至最終步入國際市場的影響都是及其嚴重的。故應加強獸藥監管方面的工作力度，將用藥規范做到最合理化，將藥物殘留對人的危害降到最低，避免我國在國際市場的競爭力受到影響。