3D打印中膠原蛋白應用的研究進展

張靜，席玉松，張俊杰*

1. 淮海工學院海洋生命與水產學院（連云港 222000）；2. 中復神鷹碳纖維有限公司（連云港 222000）

膠原蛋白具有優良的生物學性質與功能，主要表現在免疫原性低、可生物降解性、生物相容性、促進細胞生長和血小板凝聚等方面。這些生物學特性與功能，使得膠原蛋白在生物醫學領域被廣泛應用于生物材料制備[1]。3D生物打印技術是指在計算機輔助下，按照預先設計的特定三維結構，對活細胞、生物活性組織及相關生物材料等基本構件進行逐層堆積的生物制造技術[2]。3D打印技術被逐漸引入生物醫學領域。在一些生物材料支架制備過程中，膠原蛋白憑借著低毒性、可體內降解等優勢，逐漸成為3D生物打印原材料的優先選擇。

1 膠原蛋白的基本結構

膠原蛋白是一種天然的生物大分子，是哺乳動物細胞中含量最豐富的蛋白質，約占整個細胞總蛋白的1/4[3]。目前，已發現27種不同類型膠原蛋白，分別標記為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型……其中，Ⅰ型膠原是組織分布最為廣泛的一類膠原蛋白。典型的膠原蛋白分子是緊密結合的三螺旋結構，由3條肽鏈組成，包括2條α1鏈和1條α2鏈，3條肽鏈交互纏繞形成繩索狀的超螺旋結構[3]，膠原蛋白分子結構十分穩定。

2 膠原蛋白的生物學特性

2.1 免疫原性低

膠原蛋白結構重復率較高，相比于其他具有免疫性的蛋白質，膠原蛋白免疫原性更低。因為，膠原蛋白的主要免疫原性位點是在分子的C、N末端區域，該區域被稱為端肽，是由短的、非螺旋氨基酸序列所組成。在膠原蛋白提取過程中，端肽會被選擇性水解或者去除而失去活性，僅在膠原蛋白分子的三股螺旋結構內保留一些微弱的免疫原性[4]。

2.2 可生物降解性

高分子生物降解是指材料在生物體內，能夠被酶或微生物促進降解，高分子主鏈斷裂、分子量逐漸變小，最終成為單體或代謝產物[5]。膠原蛋白緊密的螺旋結構使得大多數蛋白酶只能切斷膠原蛋白的側鏈，削弱膠原蛋白分子之間交聯。膠原蛋白肽鍵只有在膠原酶作用下才會被破壞，人體內部組織中存在的膠原酶對促進膠原蛋白降解發揮很大作用[6]。

2.3 生物相容性

膠原蛋白具有良好的親和性，能夠幫助細胞和組織維持正常的生理功能。同時，優良的親和性有利于細胞外間質網絡狀構成，提高細胞黏結性，使得膠原蛋白具有一定修復作用[7]。

2.4 促進細胞生長

膠原蛋白是細胞外間質的主要成分，也是細胞生長的良好培養基。在細胞的遷移、增殖過程中，膠原蛋白不僅提供營養基礎，還起到支架作用[8]。陳悅玲等[9]發現膠原蛋白能引導上皮細胞遷移到人體缺損區，從而促進角膜上皮損傷修復及細胞生長。同時，膠原蛋白的降解產生物能夠被新生細胞利用，合成新的膠原蛋白，在細胞中起到連接作用。

2.5 止血性

膠原蛋白具有促進血小板凝聚和血漿結塊功能[10]。膠原蛋白纖維與血液接觸后，血液中的血小板會與膠原蛋白纖維吸附在一起，發生凝聚反應，從而生成纖維蛋白，進而形成血栓，促進血漿結塊達到阻止流血、促進凝血目的[1]。

3 膠原蛋白在3D打印技術中的應用研究進展

在生物醫學領域中，膠原蛋白被廣泛用于制備人工組織工程支架、可吸收手術縫合線、止血海綿、人工骨骼、人造皮膚、心臟瓣膜等醫用材料。

3.1 打印組織修復材料

3D生物打印技術可用于組織修復材料的打印，如皮膚、人工軟骨等。膠原蛋白對上皮細胞起到增生修復的作用，有利于促進創面的愈合，可廣泛應用于燒傷和創傷治療。Lee等[11]利用膠原蛋白為原料，逐層打印出仿皮層和真皮層的多層皮膚組織，并將打印成型的三維皮膚浸泡于培養基內，促進皮膚組織的成熟與分層。Koch等[12]將細胞與膠原蛋白混合，打印出多層皮膚結構，研究結果顯示，細胞能夠很好地進行增殖生長并形成連接。3D打印可根據傷口面積的大小精確打印出所需要皮膚，避免患者自體移植的手術痛苦。Yang等[13]利用Ⅰ型膠原蛋白與海藻酸鈉混合材料打印出軟骨組織。

3.2 打印組織替代物

膠原蛋白可作為多種組織替代物用于生物醫學領域。有關數據顯示，全球每70名角膜損傷患者中，只有1人有機會得到角膜移植，可供移植的角膜數量遠不能滿足患者需求。英國紐卡斯爾大學遺傳醫學研究所研究人員將膠原蛋白、海藻酸鹽及人類角膜細胞混合制備為打印原材料，通過對患者眼睛進行掃描，得到角膜大小、形狀等數據，利用3D打印技術打印出成型的人體角膜[14]。整個打印過程不到10 min，但打印出的角膜尚未經人體試驗，一旦打印出的角膜被證明能用于人體移植，這一技術將造福于人類。

3.3 打印組織工程支架

在現今生物醫學領域中，組織工程支架無疑是研究熱點。生物支架是細胞黏附的基本框架，也是細胞增殖分化場所，在構建仿生組織和器官中起到重要作用。如利用自體軟骨細胞移植治療軟骨損傷，既不易獲得且容易造成二次傷害[15]；如使用異體軟骨移植，無法完全避免排斥反應，并且生物學性能、功能和正常軟骨組織相比差距較大[16]。將膠原蛋白作為主要原料打印出的組織工程支架，有利于細胞黏附，對細胞起到支撐保護作用，使得軟骨損傷完全修復成為可能[17]。

3D打印的支架原料大體來自兩類：一類由人工合成的生物材料制成，主要包括聚乳酸、聚氨基酸、聚羥基乙酸及聚偶磷氮[18]；另一類來自動植物體內的天然生物材料，包括膠原蛋白、殼聚糖、纖維蛋白和海藻酸鹽[19]。孫凱等[20]以絲素、膠原蛋白2種材料為打印基質，利用3D打印技術打印出組織工程支架。絲素與膠原蛋白質量比2︰1時，支架的理化性質與生物相容性最佳。袁清獻等[21]采用絲素蛋白和Ⅱ型膠原蛋白作為支架的原材料，通過3D打印和冷凍干燥技術制備出具備網格狀的三維軟骨支架。在支架上接種軟骨細胞，細胞可以很好地進行增殖分化，符合軟骨組織工程的要求。朱旭[22]對3D打印的膠原蛋白-殼聚糖支架在脊髓的損傷修復方面發揮作用進行研究，打印的支架具有完美的內部三維立體多孔結構，能促進脊髓神經纖維再生及運動功能恢復。

組織工程是3D生物打印技術中最前沿的研究領域，由于3D技術具有個性化、準確性及擅長制作復雜實體特點，為疾病治療找到發展方向。

4 水產膠原蛋白在3D打印中的應用現狀

4.1 應用現狀

水產膠原蛋白在一定程度上可以替代陸生動物膠原蛋白在3D打印中所發揮作用。朱偉等[23]通過研究發現，從魚鱗中提取的膠原蛋白對免疫低下小鼠的皮膚傷口具有明顯促進愈合作用。Van Essen等[24]研究從魚鱗中提取膠原蛋白，發現其透光度和散射性與人類角膜的性質基本一致，能滿足人類角膜組織構建基本要求。Mredha等[25]利用魚鰾提取膠原蛋白，制備成水凝膠用于人工軟骨及骨修復材料中，該水凝膠與骨質結合極為緊密，且機械強度較高，承重性能好，是一種良好生物材料。相較于陸生動物所提取的膠原蛋白，水產膠原蛋白具有污染性小、生物安全性高等特點。由于中國水產資源豐富，水產養殖、加工業的發展產生大量魚皮、魚鱗等下腳料，使得提取膠原蛋白所需的原料價格較為低廉。

在一些伊斯蘭國家，由于宗教信仰等原因，從豬皮、豬骨中提取的膠原蛋白所制備的產品不能被穆斯林民眾所接受。而水產膠原蛋白由水產品中提取，避免宗教禁忌問題，幫助膠原蛋白產品破除宗教壁壘，并發揮效用。

3D打印中，水產膠原蛋白能夠發揮與陸生動物膠原蛋白同樣作用，且具有安全無毒、價格便宜等優勢，為3D打印的使用材料提供選擇。

4.2 存在問題

作為3D打印材料，相比于豬、牛等陸生動物膠原蛋白，水產膠原蛋白雖然更安全，但同時也存在熱穩定性低的問題。膠原蛋白的三螺旋結構會隨著溫度升高而解開，形成單條肽鏈，加熱變性后的膠原蛋白理化性質會發生較大改變[26]。

張俊杰等[27]從鱈魚皮中提取酸溶性膠原蛋白（ASC），經分析發現其變性溫度19.0 ℃。卓素珍[28]測得從鯧魚皮、鮟鱇魚皮中提取的膠原蛋白熱變性溫度分別為21.91和22.09 ℃。段蕊等[29]研究冬夏鰱魚鱗膠原蛋白穩定性，結果顯示，夏季樣品變性溫度36℃，冬季樣品出現2個值，分別為30和34 ℃。張俊杰等[30-31]從鯉魚皮中提取的膠原蛋白變性溫度28 ℃，從鯉魚鱗所提的酸溶性和酶溶性膠原蛋白（PSC）變性溫度分別為32和28 ℃。張建忠[32]測得的草魚皮ASC和PSC熱變性溫度分別為33.8和34.5 ℃。而豬皮膠原蛋白的變性溫度38.91 ℃，牛跟腱膠原蛋白的變性溫度

38.10 ℃。

一般情況下，從豬、牛等陸生動物中提取的膠原蛋白熱穩定性高于水產動物中提取的膠原蛋白，淡水魚提取的膠原蛋白變性溫度較高于海水魚。打印過程中，由于水產膠原蛋白的熱穩定性較低，容易使材料性質發生改變，且由于陸生動物膠原蛋白的熱變性溫度更接近人體溫度，比水產膠原蛋白更能滿足于組織工程的應用。

5 打印過程中的問題

5.1 造價昂貴、定制周期長

3D打印技術所制造的產品需要根據患者情況進行打印，能夠滿足于個性化需求，但也由于個性化的特點，無法做到批量生產，生產造價高，成本昂貴。同時，因為患者情況各不相同，每次的產品都需重新制定打印方案，所耗費時間較長。

5.2 生物安全性問題

現在的3D生物打印所打印出的組織器官大多通過動物實驗檢驗成果，但動物體內環境與人體環境有很大區別，動物實驗的成功并不能代表打印出的組織器官完全適用于人體。生物打印所選用的打印基質是從動物體內提取的膠原蛋白，與人體自身的膠原蛋白有一定差異性，要考慮免疫排斥、外源性病毒感染等問題。

5.3 機械強度差

以膠原蛋白為原料打印的支架不僅有利于細胞黏附，并且對細胞起到支持保護作用，但是存在機械應力強度不足問題。支架的孔隙結構對支架的力學性能影響極大，打印出的支架三維結構內部的孔徑大小和形狀對細胞增殖與遷移有重要意義。膠原蛋白作為打印基質所打印的支架，微孔結構、孔徑和空隙率并不能達到理想效果。

6 展望

3D打印技術有著數字化、信息化、準確化等優勢，逐漸成為如今生物醫學領域的研究熱點和發展方向。盡管中國3D打印技術起步較晚，但近年來已打印出肝臟、血管等人體組織器官。3D打印技術可以更好地應用于生物醫學領域，為人類健康做出貢獻。同時，水產膠原蛋白來源廣泛，可以從水產品下腳料中提取，原料價格低廉，并可達到節約資源、保護環境的目的。然而，水產膠原蛋白在3D打印中應用較少，主要由于熱穩定較差，且結構、功能與陸生動物來源的膠原蛋白有一定差異性。但從各類魚的變性溫度可以看出，淡水魚提取的膠原蛋白變性溫度普遍高于海水魚，且較接近陸生動物的變性溫度，通過體外自組裝等方法可以提高膠原蛋白熱穩定性，有望使淡水魚作為陸生動物膠原蛋白替代品。為更好發揮水產膠原蛋白應用潛力，應開展大量基礎研究及臨床試驗，為水產膠原蛋白的使用提供依據。