微波輔助優化亞側耳多糖提取工藝的研究*

張致呈,劉 燕,趙志剛,李貴文

（皖南醫學院藥學院，安徽 蕪湖 241002）

亞側耳,又叫做元蘑(產地黑龍江一帶）、冬蘑、黃蘑,形似扁狀半圓形和腎臟形,以黃綠色為主,有一定粘度。亞側耳主要生長在腐爛的闊葉樹中,分布在北方、川藏地區,是一種木腐朽菌,可以食用[1]。中醫學理論認為,亞側耳性甘、溫和,可以祛火清熱,排除濕氣,在治療肝硬化、癲癇等方面有顯著效果,同時還能夠減輕肌肉疼痛,消除眼睛紅腫、脹痛等病癥[2]。多糖是亞側耳的主要成分,也是有藥用價值的部分,亞側耳多糖一方面可以直接殺傷腫瘤細胞,另一方面還可以免疫調節人體。亞側耳多糖能夠降低輻射所致的免疫功能損傷影響,而且還能增強機體的防御能力,同時還能降低和修復化療藥物對機體免疫系統的破壞,起到增效減毒的作用,它體現了中醫的精髓[3-4]。目前,關于亞側耳的研究多集中于藥理方面,而在提取工藝方面的研究較少,本次試驗首次采用正交設計對微波輔助提取亞側耳多糖的工藝條件進行優化,為亞側耳活性多糖的工業化生產提供一定的依據。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

RE5298標準旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠；MD6A微波樣品處理系統,北京盈安美誠科學儀器有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計,上海元析第三分析儀器廠；AB104-N電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司。

亞側耳(購于毫州藥材市場）；95%乙醇、葡萄糖、濃硫酸、氯仿、正丁醇、苯酚、無水乙醇等均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖含量的檢測

用葡萄糖作為標準品,采用硫酸—苯酚法進行檢測[5]。

1.2.2 標準曲線繪制

取六只50 mL容量瓶,將已經烘干過的葡萄糖作為標準品配置所需要的標準液。分別取 0 mL、3 mL、6 mL、9 mL、12 mL、15 mL標準葡萄糖溶液加入容量瓶中,分別添加一定量蒸餾水定容搖勻。從上面得到的六只容量瓶中各自取1 mL溶液加入試管中,依次將0.6 mL 5%的苯酚溶液和3 mL濃硫酸加入試管中,振蕩使它們充分混合均勻,然后把試管放入60℃水中開始恒溫反應20 min,等待反應完畢后,停止加熱,將試劑冷卻至室溫,把試劑樣品放入分光光度計,選擇波長為490 nm進行吸光度測量,結合測量數據繪制標準曲線,得到如下回歸方程:

式中:A——吸光度

C——葡萄糖濃度, μg/mL

1.2.3 微波輔助萃取方法

將亞側耳原材料干燥后粉碎經石油醚、乙醇脫脂,然后乙醇提取,去除其中的醇溶性雜質和單糖,過濾后殘渣晾干備用,稱取5 g除脂后的亞側耳粉,加入規定用量的溶劑,靜置一定時間潤濕物料,然后恒溫條件下微波提取一定時間,累計提取兩次,抽濾提取劑,合并濾液,用旋轉蒸發儀濃縮到原體積的1/5左右,除去蛋白質,醇沉后用無水乙醇淋洗,取出干燥得粗多糖。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取時間對得率的影響

觀察圖1中曲線走勢,不難發現當溫度等其他因素保持不變時,微波提取時間不斷變大,曲線持續上升,提取得率也在上升,提取時間到達10 min時,提取得率也隨之到達最大值,發現提取時間超過10 min后,如果繼續提取,時間并不影響亞側耳多糖的提取得率,時間越長反而有所下滑,說明此時多糖已經基本完全溶解提取,時間過長多糖發生其他反應分解。因此10 min是多糖最佳的微波提取時間。

圖1 提取時間對得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on yield

2.1.2 液料比對得率的影響

圖2 液料質量比對提取得率的影響Fig.2 Effect of liquid mass ratio on extraction yield

觀察圖2,當提取時間等其他條件保持不變時,當液料比逐漸上升的時候,亞側耳多糖的得率也逐漸提高,在液料比為30∶1的時候達到最大值,繼續增加液料比得率基本不變甚至有所下降,可能是液體量太多影響結果。因此經過多種考慮選擇30∶1的液料比最佳。

2.1.3 提取溫度對得率的影響

根據圖3曲線走勢不難發現,當溫度為70℃時得率為峰值,表示此溫度下多糖基本被全部提取。溫度過高得率下降可能是多糖在高溫下發生分解。因此微波提取的最佳溫度為70℃。

圖3 提取溫度對提取得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield

2.1.4 提取次數對得率的影響

由圖4曲線走勢可知,當提取次數為2時,得率已經接近最大值,次數增加得率緩慢上升后基本不變,表明提取兩次已基本提取完全。因此微波提取的最佳提取次數為2。

圖4 提取次數對得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on yield

2.2 正交實驗

表1 實驗因素水平Table 1 Factor level of experiment

為了優化微波提取工藝,了解各因素之間相互關系和影響范圍。將溫度(A）、亞側耳多糖的液料比(B）、亞側耳多糖的微波提取次數(C）、亞側耳多糖的提取時間(D）四個因素進行正交實驗,選擇使用L9(34）正交表。正交實驗結束后,結合實驗數據和正交表,判斷提取得率和它們的關系,明確了影響因素的優先級順序:A＞D＞C＞B,同時,聯系社會生產實際過程,得到最佳提取工藝條件為 A3B3C2D2。即:設置提取溫度為80℃,將亞側耳多糖的液料比確定在35∶1,分別提取兩次,每次都提取10 min,此時提取效果最佳。同時為了保證實驗結果的準確性和可靠性,以正交實驗得到的最佳工藝條件為基礎進行平行試驗,計算得率的平均值,結果為15.16%。由此可見,實驗結果是可以再現的,有效的。

表2 正交實驗設計表及結果Table 2 Orthogonal experiment chart and result

3 結 論

通過單因素實驗和正交實驗優化了提取工藝,本實驗結果表明,在溫度為80℃條件下,對液料比為35∶1的亞側耳重復提取兩次,每次10 min,此時的得率最高。相比傳統方法,微波提取技術有效提升了亞側耳多糖的提取率,同時可以縮短提取時間,簡化提取工藝,在工業化生產過程中有一定指導作用。