數字PCR 技術的發展與展望

孫華偉，張敬峰，張小飛＊

（江蘇省農業科學院獸醫診斷檢測中心，江蘇 南京 210014）

2019 年10 月24 日-27 日，第22 屆中國北京國際科技產業博覽會在中國國際展覽中心隆重開幕，并發布首臺國產全自動一體化數字PCR 儀，受到國內業界廣泛關注。數字PCR 被稱為“第三代”PCR技術，更擅長對復雜背景下的標本、極微量核酸標本進行檢測，無疑將更好地解決非洲豬瘟的快速、科學診斷在養豬臨床中的實際應用。

1 PCR 技術的發展歷程

PCR 是模板DNA、引物和dNTP 在DNA 聚合酶作用下發生酶促聚合反應，特異性地合成特定核酸片段并達到富集的目的，實現體外擴增，得到所需數目的DNA，然后通過凝膠電泳或熒光定量等方式實現定性或者定量檢測的方法。使用該方法，即使只有微量的樣本，也能夠通過大量的體外復制將病原信號加以放大，實現比較準確的診斷檢測。PCR 技術的發展歷程，見圖1。

2 數字PCR 比傳統技術在臨床使用中有何優勢？

2.1 數字PCR 可實現檢測結果的高度重復性

圖1 PCR 技術的發展歷程

圖2 Q- PCR 標準曲線

什么樣的檢測結果才算是可靠的？這個問題非常重要，尤其是在非洲豬瘟疫情肆虐的當下。任何科學的檢測，可重復性都是必須要強調的，相信不少做過Q-PCR 的實驗室檢測人員碰到過，由于重復性差而令人崩潰的時刻。

Q-PCR 被認為是實驗室檢測的常規操作，但由于在Q-PCR 檢測過程中影響擴增效率的因素眾多，比如PCR 抑制物、酶等，不能保證其定量分析所依賴的基礎—循環閾值（CT）的恒定性，使得相同實驗不同次重復檢測結果的重現性較差，甚至可能會得到完全相反的結果，無法滿足越來越嚴格的定量要求。與Q-PCR 不同的是，數字PCR 不依賴于CT 值，因此不受擴增效率影響，能夠將誤差控制在5%以內，實現檢測結果的高度重復性。

2.2 可以擺脫對標準品的依賴

在病毒的核酸載量測定方面，Q-PCR 技術的最大瓶頸在于需要依賴標準曲線。因為定量時需要的標準品既沒有商品化，自己制備起來又很費時費力。數字PCR 基于單分子層面的計數可以擺脫對標準品的依賴，從而實現對病毒核酸的精準絕對定量。利用數字PCR 進行核酸的病毒載量測定，依賴其高靈敏度的特點，可以用于早期診斷和低拷貝病毒的監控，且血液和唾液是數字PCR 技術主要應用的標本類型，見圖2。

3 數字PCR 在獸醫檢測推廣中可能會遇到的問題

數字PCR 實驗室檢測尚無國家或行業統一標準，同時，數字PCR的靈敏度較高，因此做好實驗室內部質量控制，建立規范標準的檢測操作流程和結果評估分析規程是保證檢測結果準確性和可靠性的前提。

4 展望

數字PCR 早已引起生物醫學研究者的廣泛關注，但在獸醫檢測領域仍處于萌芽階段。數字PCR 的策略很簡單，就是“分而治之”，這是一個很好的比喻。DNA 樣品分別在獨立但相同的分區中進行擴增。非洲豬瘟的橫空出世，極大促進了Q-PCR 的普及[1]。但通過對江蘇省多家實驗室的臨床調研發現Q-PCR在非洲豬瘟病毒的檢測中，重復性差是一個反映較為集中的問題。就目前而言，數字PCR 仍是比較前沿的技術，但相信在不久的將來，隨著數字PCR 在生物醫學領域應用的逐漸成熟，數字PCR 在獸醫檢測領域扎根發芽是非常值得期待的，非洲豬瘟的橫空出世將催化這一進程。

在非洲豬瘟的防控方面，檢測結果的準與不準是兩個不同的世界，隔著它們的那層窗戶紙，就是檢測技術的科學性。