稀土殼糖胺螯合鹽對熱應激黃羽肉雞脂肪組織學和ABCG1表達的影響

彭夢玲 董 靜 劉 琦 胡文業(yè) 張粟子 王菊花 周 杰

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，合肥 230036)

因環(huán)境溫度超過等熱區(qū)(Thermoneutral zone)上限，導致動物的非特異性反應稱為熱應激[1]。熱應激是制約肉雞養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)效率的主要因素之一[2]，主要表現(xiàn)在：肉雞在采食量、飼料轉化率、生長速度的顯著下降；同時伴有生理機能紊亂的發(fā)生[3-4]。研究表明持續(xù)或間歇性高溫可對雞營養(yǎng)代謝利用、腸道菌群、生理免疫等產(chǎn)生綜合負面影響[5-7]，尤其容易引起脂肪沉積[8-9]。

稀土殼糖胺螯合鹽(Rare earth-chitosan chelate，RECC)具有類似抗生素作用，主要以稀土硝酸鹽與殼糖胺為原料，經(jīng)特殊電化學工藝加工而成，安全性高，是一種新型飼料添加劑[10]。RECC可提高禽類和反芻動物的飼料利用率，并促進其體內(nèi)生長因子和激素的釋放，進一步增加機體免疫力[11-12]。RECC可促進蛋雞新陳代謝，提高產(chǎn)蛋率[13]。

ATP結合盒轉運體G1(ATP binding cassette transporter G1，ABCG1)是ATP結合盒轉運體(ATP binding cassette transporter，ABC)超家族中的一員。ABCG1通過消耗ATP介導蛋白質、膽固醇、磷脂等多種物質的跨膜轉運，主要存在于細胞膜上[14]。已有研究表明ABCG1可介導膽固醇外排，并緩解巨噬細胞氧化應激反應[15]。此外，ABCG1可通過抑制巨噬細胞中脂質過量積累防止動脈粥樣硬化的發(fā)生[16,17]。熱應激可導致脂肪沉積，ABCG1可抑制脂肪沉積。然而，RECC對熱應激肉雞脂肪沉積的影響卻鮮有報道，且RECC是否影響熱應激條件下ABCG1mRNA表達水平仍然未知。因此，本研究擬從脂肪組織學角度探討RECC對熱應激條件下肉雞脂肪沉積的影響，以黃羽肉雞為研究對象，利用組織學和實時熒光定量(qRT-PCR)方法，檢測RECC對熱應激處理下皮下、肌內(nèi)和內(nèi)臟脂肪細胞大小及ABCG1mRNA表達的影響，以期探明RECC是否通過ABCG1mRNA表達的變化影響熱應激導致的脂肪沉積，為RECC進一步在禽類熱應激中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取90只1日齡黃羽肉雞(合肥立華畜禽有限公司)，按照飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)至29日齡，開始進行熱應激處理。肉雞隨機分為3組：對照組(飼養(yǎng)溫度25±0.05 ℃+基礎日糧)、熱應激組(飼養(yǎng)溫度37±0.05 ℃+基礎日糧)和RECC組(飼養(yǎng)溫度37±0.05 ℃+基礎日糧+0.03% RECC)，每組30 只。熱應激處理時間分別7 d和14 d。

1.2 主要試劑及儀器

稀土殼糖胺螯合鹽由武漢楚興國盛科技有限公司提供，稀土有效成分為鑭和鈰，稀土殼糖胺螯合鹽含量≥45%。Total RNA Kit II(OMEGA)、RNA Loading Buffer(上海生物工程有限公司)、cDNA反轉錄試劑盒(TaKaRa)、2×TaqPCR MasterMix(TIANGEN)、核酸染料(TIANGEN)、DNA Marker(TIANGEN)、5×TBE buffer(上海生物工程有限公司)。

主要儀器有：熒光倒置顯微鏡(37XB，上海光學儀器六廠)；PCR儀(MJ Mini伯樂，美國)；高速冷凍離心機(2K-15，珠海黑馬科技有限公司)；高壓蒸汽鍋(SYQDSX-280，上海申安醫(yī)療器械廠)；酶標儀(EON，美國伯騰儀器有限公司)；手掌型離心機(LX-100，江蘇其林貝兒儀器制造有限公司)。

1.3 采樣及切片制備

分別在熱應激處理的第7 天和第14 天，每組隨機選取15 只雞進行屠宰，屠宰前給雞禁食12 h，采集其皮下(頸部)、內(nèi)臟(肌胃周圍)和肌間(腿肌)脂肪組織，在Bouin液中固定24 h，進行HE染色，染色程序如下：組織修塊(約為1.5 mm×1.5 mm×3 mm)后，放入脫水筐中，流水沖洗過夜；用梯度酒精進行脫水，濃度依次為75%、85%、95%、95%、100%和100%，每個濃度45 min；將組織塊放入二甲苯溶液中約30 s，再放入盛有液體蠟的燒杯中浸蠟，60 ℃ 3 h；用鑷子取出組織塊，放入包埋筐中，并倒入溶化后的液體蠟，動作要迅速；待蠟凝固后，以 5 μm 厚度進行切片，在50 ℃水中平展后粘附到載玻片上，并置于60 ℃恒溫箱中3 h；將含有組織的載玻片按照以下順序進行染色：二甲苯溶液(10 min)、二甲苯溶液(10 min)、100%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、85%酒精(5 min)、75%酒精(5 min)、蘇木精(5 min)、水中輕晃漂洗、1%鹽酸(5 s)、流水沖洗(10 min)、伊紅(1 min)、流水沖洗(1 min)、75%酒精(5 min)、85%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、100%酒精(5 min)、二甲苯(5 min)、二甲苯(5 min)；封片，晾干后，用顯微鏡進行拍照。

1.4 ABCG1 mRNA表達水平檢測

脂肪組織總RNA提取方法參照OMEGA公司Total RNA Kit試劑盒說明書，利用Nandrop測定總RNA濃度和純度。取2 μg總RNA進行反轉錄，反應體系和參數(shù)設置參照試劑盒說明書進行。獲得cDNA后，對內(nèi)參基因及目的基因mRNA進行相對定量分析，即2-ΔΔCT法。本試驗以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，引物序列為：5′-AGACATCAGGGTGTGATGGTTGGT-3′(上游)，5′-TCCCAGTTGGTGACAATACCGTGT-3′(下游)，產(chǎn)物大小為125 bp。脂聯(lián)素引物序列為：5′-CTGGGTACAGGAGGAAGC-3′(上游)，5′-GAAGGACAAGGCAGTGATC-3′(下游)，產(chǎn)物大小為194 bp。ABCG1引物序列為：5′-AGATGAGGAAGGAGCATG-3′(上游)和5′-TCAGGGAAGTTCAGCAGT-3′(下游)，擴增產(chǎn)物大小為203 bp。反應參數(shù)設置為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共39 個循環(huán)，反應體系為20 μL。引物在Primer Prime 5.0軟件上設計，由上海捷瑞生物技術有限公司合成。

1.5 計數(shù)及統(tǒng)計分析

Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics Inc. Rockville MD，美國)軟件計數(shù)單個視野中的脂肪細胞數(shù)目，并測量脂肪細胞直徑(μm)平均值(用像素點的數(shù)目表示)。每份標本測量5 個視野。采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，分析方法為t檢驗，分析結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。差異顯著為P<0.05，差異極顯著P<0.01。

2 結果與分析

2.1 熱應激及RECC對不同部位脂肪細胞形態(tài)的影響

熱應激分別處理黃羽雞1和2周后，皮下、肌內(nèi)和內(nèi)臟脂肪組織HE染色結果如圖1和圖2所示：

(a)皮下脂肪細胞；(b)內(nèi)臟脂肪細胞；(c)肌間脂肪細胞。Ⅰ 對照組；Ⅱ 熱應激組；Ⅲ RECC組。(a) Subcutaneous adipocytes; (b) Visceral adipocytes; (c) Intermuscular adipocytes. Ⅰ Control group； Ⅱ Heat stress group； Ⅲ RECC group.圖1 各組黃羽肉雞熱應激1周后脂肪組織HE染色結果對比(400×，標尺=50 μm)Fig.1 HE staining of the fat tissues of yellow-feathered broilers treated with thermal stress for 1 week (400×, scale bar=50 μm)

(a)皮下脂肪細胞；(b)內(nèi)臟脂肪細胞；(c)肌間脂肪細胞。Ⅰ 對照組；Ⅱ 熱應激組；Ⅲ RECC組。(a) Subcutaneous adipocytes; (b) Visceral adipocytes; (c) Intermuscular adipocytes. Ⅰ Control group； Ⅱ Heat stress group； Ⅲ RECC group。圖2 熱應激2周脂肪組織HE染色結果(400×，標尺=50 μm)Fig.2 Results of HE staining of fat tissues treated with thermal stress for 2 weeks (400×, scale bar=50 μm)

與對照組相比，肉眼可見各部位脂肪細胞直徑在熱應激組有增大；經(jīng)RECC處理后，各部位脂肪細胞直徑減小，需進一步統(tǒng)計分析。

2.2 熱應激及RECC對不同部位脂肪細胞半徑的影響

為分析顯微鏡下觀察到的結果的準確性，進一步利用Image-Pro Plus 6.0分別對各處理組皮下、肌內(nèi)和內(nèi)臟脂肪細胞大小及數(shù)量進行統(tǒng)計，結果見表1。熱應激1 周后，與對照組相比，肌間脂肪細胞直徑在熱應激處理組增大了12.12%(P<0.01)；與熱應激處理組相比，肌間脂肪細胞直徑在RECC處理組顯著減小了23.27%(P<0.01)。皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪細胞直徑在熱應激處理組，與對照組相比無顯著變化；而皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪細胞直徑在RECC處理組與熱應激組相比分別減小了20.71%(P<0.01)和14.87%(P<0.01)。本研究結果表明熱應激1 周可顯著增大肉雞肌間脂肪細胞直徑，對皮下和內(nèi)臟脂肪細胞直徑變化無顯著影響；RECC可顯著減小皮下和內(nèi)臟脂肪細胞直徑。

熱應激2周后，皮下脂肪細胞直徑大小在各處理組均無顯著變化(表2)。與熱應激組相比，內(nèi)臟脂肪細胞直徑大小在RECC處理組顯著減小了9.00%(P<0.05)；與對照組相比，肌間脂肪細胞直徑大小在熱應激處理組顯著增大了12.83%(P<0.01)，而用RECC處理后與熱應激組相比顯著減小了14.18%(P<0.01)。表明RECC對熱應激處理兩周導致的內(nèi)臟和肌間脂肪細胞直徑增大具有一定抑制作用，而熱應激和RECC對皮下脂肪細胞直徑無顯著影響。

表1 熱應激1 周對黃羽肉雞各部位脂肪細胞直徑大小的影響Table 1 Effects of thermal stress on the diameter of fat cells of yellow-feathered broilers μm

表2 熱應激2 周對黃羽肉雞脂肪細胞直徑大小的影響Table 2 Effects of two weeks of thermal stress on the diameter of fat cells in yellow-feathered broilers μm

2.3 熱應激1周和2周黃羽肉雞內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪、肌間脂肪脂聯(lián)素mRNA的表達水平

熱應激1周后，皮下脂肪、內(nèi)臟和肌間脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達水平與對照組相比，均顯著下降(P<0.05)；與熱應激組相比，皮下脂肪和肌間脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達水平在RECC處理組顯著升高(P<0.05)(圖3)。脂聯(lián)素具有抑制脂肪沉積的作用，其表達水平在RECC處理組顯著升高，表明脂肪沉積被抑制(圖3)。

*和**分別代表組間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同。* and ** mean significant differences between groups at P<0.05 and P<0.01 levels，respectively．The same below.圖3 熱應激1周各脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達水平Fig.3 Expression levels of adiponectin mRNA in different adipose tissue after one week of thermal stress

如圖4所示，熱應激2 周后，內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達水平與對照組相比，顯著下降(P<0.05)，在肌間脂肪組織中極顯著下降(P<0.01)；與熱應激組相比，肌間脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達水平極顯著升高(P<0.01)。表明隨著熱應激處理時間的延長，熱應激與RECC對肌間脂肪沉積的影響最為顯著。

圖4 熱應激2周各脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達水平Fig.4 Expression levels of adiponectin mRNA in different adipose tissue after two weeks of thermal stress

2.4 熱應激1周和2周黃羽肉雞內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪、肌間脂肪ABCG1 mRNA的表達水平

如圖5所示，熱應激1 周后，熱應激組皮下脂肪和肌間脂肪ABCG1mRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)，RECC組皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪ABCG1mRNA的表達量顯著高于熱應激組(P<0.05)，極顯著高于對照組(P<0.01)，RECC組肌間脂肪ABCG1mRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)。

圖5 熱應激1周RECC對各脂肪組織中ABCG1基因表達的影響Fig.5 Effect of RECC on the expression of ABCG1 mRNA in different adipose tissue after one week of thermal stress

圖6 熱應激2周后RECC對不同脂肪組織中ABCG1基因表達的影響Fig.6 Effect of RECC on the expression of ABCG1 gene in different adipose tissue after two week of thermal stress

如圖6所示，熱應激2 周后，皮下脂肪熱應激組ABCG1mRNA的表達量極顯著高于對照組和RECC組(P<0.01)，內(nèi)臟脂肪熱應激組ABCG1mRNA的表達量顯著高于對照組和RECC組(P<0.05)，肌間脂肪熱應激組ABCG1mRNA的表達量極顯著高于對照組(P<0.01)。

3 討論與結論

3.1 熱應激對肉雞脂肪細胞大小的影響

脂肪過度沉積影響胴體品質和人類健康[18]，熱應激可促進肉雞脂肪合成并導致脂肪沉積。Ain等[19]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度為32 ℃時，4～7周齡肉雞腹脂、皮下脂肪和肌間脂肪沉積率分別增加15%、21%和22%(以活體重計)。脂肪細胞的增大和增殖導致脂肪沉積，動物在胚胎期脂肪組織的生長發(fā)育主要由于前脂肪細胞的增生，在出生后主要是脂肪細胞的肥大[20]。CLA減少腹脂沉積主要是通過抑制脂肪細胞肥大而不是脂肪細胞增殖。本試驗發(fā)現(xiàn)熱應激處理1和2周后，肌間脂肪細胞直徑與對照組相比顯著增加，表明熱應激可顯著增大肌間脂肪細胞[21-22]。

3.2 RECC對熱應激條件下脂肪細胞大小的影響

RECC具有類似于纖維素的結構，在動物體內(nèi)可以結合飼糧中的脂肪，形成膠體，從而降低脂肪在體內(nèi)的消化吸收；或者通過提高卵磷脂膽固醇酰基轉移酶的活性和調節(jié)前體物的合成量；達到降低脂肪沉積的作用[23]。RECC通過影響超氧化物歧化酶活性調節(jié)機體脂質過氧化水平，但其對脂肪細胞大小變化的影響仍不清楚[24]。為探討RECC對熱應激條件下脂肪細胞大小的變化，本研究在飼料中添加RECC測定其對熱應激條件下肉雞脂肪細胞大小的影響，結果顯示熱應激1周后RECC可顯著減小皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪細胞直徑(P<0.01)，而熱應激2周RECC對熱應激處理導致的內(nèi)臟和肌間脂肪細胞直徑增大具有一定抑制作用，對皮下脂肪細胞直徑無顯著影響。表明RECC對各部位脂肪細胞的影響與熱應激處理時間密切相關。皮下脂肪細胞直徑隨熱應激處理時間的延長不易被RECC影響。

3.3 RECC和熱應激對ABCG1 mRNA表達水平的影響

ABCG1是一種脂質轉運體，其活化或過表達可促進細胞內(nèi)膽固醇外流[25]。Haung等[26]研究發(fā)現(xiàn)，ABCG1通過升高細胞內(nèi)高密度脂蛋白(HDL)的濃度，促進膽固醇外排，從而緩解或抑制動脈粥樣硬化。Ooi等[27]和薛嘉虹等[28]研究發(fā)現(xiàn)在氧化應激情況下，ABCG1的表達量上調，通過膽固醇外排，從而減少血管內(nèi)脂肪沉積。在本研究中發(fā)現(xiàn)，熱應激可導致脂肪細胞的增大，進一步導致脂肪沉積，RECC可緩解熱應激導致的脂肪細胞增大。因此，本研究探討RECC和熱應激對ABCG1mRNA表達水平的影響。在熱應激條件下，ABCG1mRNA表達量顯著高于對照組，表明ABCG1mRNA通過脂質外排，抑制應激條件下脂肪沉積。熱應激1 周后RECC組各脂肪組織中ABCG1mRNA表達水平均顯著高于熱應激組，說明RECC在熱應激條件下抗脂肪沉積作用機制之一，可能與上調膽固醇逆轉運基因ABCG1mRNA的表達水平有關。值得關注的是，在熱應激2 周，RECC組ABCG1mRNA表達水平趨于對照組，表明隨著RECC的持續(xù)加入脂肪沉積得到抑制。關于RECC與膽固醇逆轉運基因ABCG1mRNA表達水平的不同機制及其能否增加膽固醇逆轉運率有待深入研究。

綜上所述，RECC可通過減小脂肪細胞直徑和促進ABCG1mRNA的表達抑制熱應激肉雞體內(nèi)脂肪沉積。