綿羊繁殖軸相關組織TPH1和TPH2基因表達分析及TPH2基因多態性與產羔數的關系

李華振 狄 冉 郭曉飛 張金龍 張效生 馬 琳 劉武軍 儲明星*

(1.中國農業科學院 北京畜牧獸醫研究所/農業部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.新疆農業大學 動物科學學院，烏魯木齊 830052；3.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381)

大多數綿羊品種(Ovisaries)具有季節性發情的特點，該類品種僅在秋、冬季節等短日照條件下出現發情行為。少數綿羊品種如小尾寒羊等可以四季發情配種產羔，顯著提高繁殖效率。因此，研究綿羊季節性發情形成的生理和分子機制，可為提高綿羊繁殖效率提供科學依據。色氨酸羥化酶(Tryptophan hydroxylases, TPH)屬于蝶呤依賴性芳香族氨基酸羥化酶家族的成員，作為褪黑激素(Melatonin, MEL)生物合成的第一個酶，在所有脊椎動物的松果體中大量表達[1]。已有研究表明褪黑激素是調控綿羊季節性發情的重要因子，因此TPH可能通過影響褪黑激素的合成，進而影響綿羊繁殖軸激素分泌進而調控動物發情行為[2]。

已發現的色氨酸羥化酶有TPH1和TPH2，這2 個基因分別位于綿羊的15號和3號染色體上。TPH1主要在胃腸道和松果體等周圍組織表達；TPH2主要在大腦和下丘腦的5-羥色胺能神經元以及腸神經系統的神經元中表達[3]。TPH能催化L-色氨酸向5-羥基-L-色氨酸(5-Hydroxytryptamine, 5-HT)的轉化，該反應是5-HT生物合成中的初始和限速步驟，而5-HT是MEL的前體產物[4]。5-HT 能神經元是胚胎最早產生的神經元之一，參與調節腦回路的結構和可塑性，并且在常規突觸建立之前通過發育的軸突釋放5-HT[5]。最初藥理學研究表明，5-HT可以調節許多發育過程，包括細胞分裂、細胞分化、神經元遷移及突觸發生[6]。5-HT在下丘腦內側視前區中能神經元突出連接GnRH神經元，能直接負調控GnRH的分泌[2]。增加內源性局部或者外周血液中5-HT水平導致促黃體素(Luteinizing hormone, LH)分泌減少[7]，并在母羊、大鼠[2]等中得到類似的結果。由于5-HT由TPH催化產生，證實TPH在上游組織中可通過調控5-HT分泌影響繁殖軸(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPGA)軸激素表達[2]。已有研究發現去卵巢母猴在雌激素(E)和孕酮(P)處理下，下丘腦局部區域TPH2mRNA表達增加[9]。人類注射雌激素后，發現E能誘導5-HT神經元中的孕激素受體(PR)和雌激素受體(ER)表達，表明TPH(尤其TPH2)可能也受到HPGA中的E影響[10]。

已有研究表明TPH能參與調控繁殖生理過程，是繁殖通路中的重要組成部分[10]。但對TPH基因在不同繁殖狀態下綿羊性腺軸相關組織中表達差異和參與季節性發情和繁殖時期轉換方面的研究鮮有報道。因此，本試驗擬以卵泡期和黃體期的成年小尾寒羊母羊(常年發情品種)和長光照和短光照條件下的蘇尼特羊母羊(季節性發情品種)為研究對象，采用qPCR法檢測TPH基因在不同繁殖狀態下綿羊繁殖軸10 種不同組織中的表達情況；并利用MassARRAY飛行質譜技術(Time-of-flight mass spectrometer, TOF-MS)[11]檢測6個綿羊品種TPH2基因多態性，通過統計學將TPH2基因多態性與綿羊2 個繁殖性狀(季節性發情和產羔數)進行關聯分析。旨在揭示或完善綿羊繁殖分子調控機制，以期提高季節性發情綿羊的繁殖效率。

1 材料與方法

1.1 試驗羊選擇及處理

選擇6 只健康狀態良好的空懷小尾寒羊母羊(采樣地點：山東省，鄆城縣)，在其陰道內放置孕酮陰道栓(Controlled intcmal drug release device，CIDR，InterAg公司，新西蘭)進行同期發情，12 d后撤栓，分別采集卵泡期(撤栓后第3天)和黃體期(撤栓后第9天)性腺軸相關組織備用。

選擇天津市畜牧獸醫研究所畜禽繁育基地人工控光條件下飼養的6 只健康狀態良好的蘇尼特羊母羊，首先在短光照(Short day, SD)條件下(光照/黑暗：8 h/16 h，人工模擬發情季節)飼養42 d后，轉至長光照(Long day, LD)條件下(光照/黑暗：16 h/8 h，人工模擬休情季節)飼養49 d，并根據文獻報道，分別在SD 21和LD 492 個時間點采集性腺軸相關組織；

分型樣品選擇：小尾寒羊(山東省鄆城縣)27 只、湖羊(江蘇省徐州市)101只、策勒黑羊(新疆維吾爾自治區和田市)52只、蘇尼特羊(內蒙古自治區烏拉特中旗)21只、灘羊(寧夏回族自治區鹽池縣)22只、草原型藏羊(西藏自治區當雄縣)161只，以及帶有產羔記錄的小尾寒羊(山東省鄆城縣)384 只。采抗凝血送北京康普森生物技術有限公司進行基因型檢測。

1.2 組織樣品采集

采集下丘腦、垂體、松果體、大腦、小腦、卵巢、輸卵管、子宮、腎臟、腎上腺等10種組織樣。樣品要在屠宰后迅速采集完成裝入2 mL RNase-Free凍存管中，立刻放進液氮中保存，所有樣品采集并保存完成后一并轉入干冰帶回實驗室，整理并保存于-80 ℃專用冰箱中。

1.3 試驗相關試劑及儀器

試驗中相關試劑主要有RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京)、反轉錄試劑盒(TakaRa，寶生物工程(大連)有限公司)和熒光定量染料(SYBR?Premix ExTaqTMII) (TaKaRa, 寶生物工程(大連)有限公司)等，相關儀器有NanoDrop 2000超微量分光光度(Thermo, 美國)、PCR儀(Eppendorf, 德國)和羅氏熒光定量儀480II(羅氏, 美國)等。

1.4 引物設計

參考GenBank綿羊TPH1和TPH2基因mRNA序列(登錄號：ENSOARG00000001345和ENSOARG00000014686)及公開文獻發表的引物信息，采用Premier 3.0在線軟件進行引物設計，由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。以β-ACTIN(登錄號：NM_001009784.1)作為參照基因。qPCR引物相關信息見表1。

表1 本研究所用RT-PCR引物信息Table 1 Primers used in this study

1.5 總RNA提取及cDNA合成

將采集的組織用RNA提取試劑盒提取總RNA，通過cDNA快速合成試劑盒反轉錄總RNA獲得cDNA。反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得cDNA第一條鏈。5 倍稀釋反轉錄產物后，用β-ACTIN(qPCR引物，見表1)做參照基因進行PCR檢測，質量合格后0 ℃保存以備檢測基因mRNA表達。

1.6 熒光定量PCR體系及標準曲線建立

用羅氏PCR儀檢測組織表達，每個樣品技術重復為3次，用β-ACTIN作為內參基因，以模板為H2O設空白對照。qPCR反應體系和反應程序相關試劑參照使用說明，標準曲線的建立體系和步驟方法參考文禹粱等(2019)，繪制TPH2 基因以及β-ACTIN基因的標準曲線[12]，反應結束后進行熔解曲線分析。

1.7 基因分型

對TPH2基因g.107854166 C>T和g.1078541669C>T 2個SNP位點在不同綿羊品種中進行分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(康普森生物技術有限公司，北京)進行基因型檢測。分型樣品選擇：常年發情品種(小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊)和季節性發情品種(蘇尼特羊、灘羊和草原型藏羊)。分型樣品為DNA(綿羊抗凝血提取)，每個樣品DNA需要量為20 μL，DNA濃度為40～80 ng/μL。

1.8 數據統計及分析

采用2-ΔΔCt法[13]計算TPH基因在各組織中的相對表達量，數據用統計學軟件SPSS 22.0進行單因素方差分析，用最小顯著差異法(Least significant difference，LSD)進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 TPH1和TPH2基因在綿羊HPGA 10種組織中的表達分析

采用qPCR技術對2 個基因在綿羊HPGA各組織中的差異表達情況進行定量分析，結果發現TPH1基因在2 個綿羊品種各組織廣泛表達(圖1)：

圖1(a)中，TPH1基因在蘇尼特羊下丘腦和松果體中短光照表達量極顯著高于長光照(P<0.01)，在蘇尼特羊垂體中短光照表達量顯著高于長光照(P<0.05)；圖1(b)中，TPH1基因在小尾寒羊垂體和卵巢中卵泡期表達量顯著低于黃體期(P<0.05)。

*代表差異顯著(P<0.05)；**代表差異極顯著(P<0.01)。下同。*indicates the difference is significant (P<0.05).**indicates the difference is highly significant (P<0.01). The same below.圖1 TPH1基因在蘇尼特羊(a)和小尾寒羊(b)的相對表達量Fig.1 Relative expression of levels TPH1 gene in sunite sheep (a) and Small Tail Han sheep (b)

2.2 TPH2基因的表達水平

檢測TPH2基因在不同繁殖狀態下蘇尼特羊和小尾寒羊性腺軸相關組織中表達量發現：TPH2基因在蘇尼特羊松果體以及腎臟中表達量較高，圖1(a)中卵巢組織中長光照下的表達量顯著高于短光照(P<0.05)；圖2(b)中TPH2基因在小尾寒羊下丘腦組織中卵泡期的表達量極顯著高于黃體期(P<0.01)。

圖2 TPH2基因在蘇尼特羊(a)和小尾寒羊(b)的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of TPH2 gene in sunite sheep (a) and Small Tail Han sheep (b)

2.3 TPH2基因多態性分析

通過MassARRAY飛行質譜技術(Time-of-flight mass spectrometer, TOF-MS)[11]檢測6個綿羊品種，得到綿羊3號染色體TPH2基因第1外顯子存在2處突變：g.107854166C>T和g.1078541669C>T，并發現g.107854166C>T為錯義突變S/L(密碼子TCG/TTG)，位于TPH2基因cDNA的第149個堿基，蛋白質的第50個氨基酸；g.1078541669C>T也屬于錯義突變P/L(密碼子：CCG/CTG)，位于TPH2基因cDNA的第152個堿基，蛋白質的第51個氨基酸。同時對6 個綿羊品種TPH2基因進行基因分型，并發現TPH2基因2 個SNP位點在單羔季節性發情和多羔常年發情品種中均存在3 種基因型，并且g.107854166C>T和g.1078541669C>T位點的CC型均為優勢基因型。

通過統計學比較單羔季節性發情和多羔常年發情組間6 個綿羊品種g.107854166 C>T和g.1078541669C>T的基因型和等位基因頻率差異，從表2可知，TPH2基因g.107854166C>T等位基因頻率在季節性、常年發情品種間差異達到顯著水平(P<0.05)，但其他的基因型頻率和等位基因頻率均沒有達到顯著差異水平。且CC為優勢基因型，C為優勢等位基因。

表2 TPH2基因不同SNP位點在季節性、常年發情品種中的基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotype and allele frequencies of different SNPs of TPH2 gene in seasonal and non-seasonal reproduction sheep

通過統計學分析TPH2基因不同SNP位點在不同綿羊品種中的群體遺傳學(表3)可知，TPH2基因的g.107854166C>T和g.107854169C>T位點在灘羊、蘇尼特羊、草原型藏羊、小尾寒羊、湖羊以及策勒黑羊6個品種中均表現為低度多態(PIC<0.25)。另外，卡方適合性檢驗結果表明，g.107854166C>T在多羔常年發情品種組間均為野生型，該位點沒有發生突變，單羔季節性發情品種間g.107854169C>T位點均處于哈代溫伯格平衡狀態(P>0.05)。

用ANOVA將候選基因的基因型與384只小尾寒羊產羔數進行關聯分析，從表4中可知，TPH2基因g.107854166C>T和g.107854169C>T位點不同基因型與小尾寒羊3 個胎次產羔數關聯后無顯著差異。

3 討 論

3.1 季節性變化對TPH基因表達的影響

TPH1是MEL生物合成第1個限速酶，在所有脊椎動物的松果體中大量產生[14]。松果體細胞中MEL的生物合成是多步驟反應，其起始于TPH將色氨酸羥基化為5-HTP，并受到色氨酸羥化酶1(TPH1)的限制[15]。本研究發現TPH1基因在蘇尼特羊松果體中的差異表達(圖1)，也驗證了上述結果[16]。在大鼠[16]和鳥[17]等動物中檢測到TPH1 mRNA呈晝夜節律表達。在溫帶鳥類的季節性發情的研究中也發現TPH1mRNA在下丘腦乳頭狀前核(Premammillary)表達，進而控制鳥類季節性發情[17]，本研究TPH1mRNA在蘇尼特羊下丘腦和松果體中短光照表達量極顯著高于長光照(P<0.01)，受到季節性信號強烈的選擇，與Kang等[17]的研究結果一致。

TPH2基因的晝夜節律已經被多項研究證明：大鼠視網膜[16]和敘利亞倉鼠(Syrianhamster)下丘腦[18]中的TPH2轉錄本顯示出明顯的光周期依賴性晝夜節律變化。然而，在鳥類下丘腦PMM中沒有檢測到TPH2mRNA表達[17]。蘇尼特羊TPH2轉錄研究中僅在卵巢組織發現差異表達。究其原因可能是TPH2mRNA表達在蘇尼特母羊中季節性節律較弱或不存在季節性節律。

3.2 類固醇激素負反饋對TPH-GnRH通路的影響

卵巢切除后在獼猴(Rhesusmacaques)[19]、恒河猴(Rhesusmonkey)[9]和大鼠[20]下丘腦中注射E，均發現丘腦局部區域TPH2mRNA表達增加。在使用E處理后的母猴5-HT神經元中TPHmRNA和TPH蛋白單細胞水平都顯著升高，證明E可誘導5-HT神經元中的PR和ER進而參與調控5-HT的分泌，表明TPH(尤其TPH2)可能受到HPGA中的E負反饋調控[10]。在下丘腦內側視前區(Medial preoptic area)中5-HT神經元突出連接GnRH神經元，能直接負調控GnRH的分泌[2]，在雌性大鼠的GnRH神經元中發現大量的5-HT受體，其中HTR2參與調控排卵，并介導5-HT間接或者直接抑制LH分泌[2]，也證明了GnRH受到5-HT/HTR2影響[21]。研究表明大鼠中存在TPH/5-HT/5-HT受體2(5-Hydroxytryptamine receptor 2)/GnRH通路調控性腺軸激素分泌[2]。

本研究qPCR檢測結果暗示小尾寒羊下丘腦TPH表達受到雌激素正反饋和負反饋的影響。綿羊發情進入卵泡期后，孕酮濃度急劇下降，孕酮的負反饋消失，在排卵前(卵泡最大時)出現平行的LH峰和E峰，當E大量分泌時，可以通過負反饋作用于下丘腦和垂體[22]。小尾寒羊卵泡期存在E反饋，作用于HPGA，調節GnRH和LH釋放分泌[23]。綜上所述并結合本研究(圖2)中TPH2基因在小尾寒羊下丘腦組織中卵泡期的表達量極顯著高于黃體期(P<0.01)的研究結果，推測綿羊下丘腦中同樣存在通路E/TPH2/5-HT/HTR2/GnRH通路。本研究小尾寒羊卵泡期組織是在卵泡達到最大時采的樣，此時正處于雌激素峰，E大量分泌，反饋作用于下丘腦5-HT神經元的TPH2，使其表達量增加，導致5-HT分泌增多，并通過5-HT神經元末端突出作用于GnRH神經元，從而調控GnRH分泌[2]。

3.3 TPH在垂體中的作用

已有研究表明增加內源性5-HT水平導致LH分泌減少[2,24]，證明TPH可以通過5-HT調控LH水平。通過注射5-HT神經毒素破壞5-HT神經元后，在大鼠中后發現抑制5-HT合成對LH分泌的促進作用[2]。在去勢大鼠腦室注射小劑量5-HT后，LH釋放減少[25]，同時也有研究報道了全身注射5-HT對閹割大鼠LH水平的抑制作用[26]。本研究發現TPH1在小尾寒羊垂體和卵巢中卵泡期顯著低于黃體期(P<0.05)結果與上述小鼠中的研究基本一致[26]。

3.4 TPH2基因多態性與綿羊產羔數之間的關系

TPH2基因的g.107854166C>T和g.107854169C>T位點在灘羊、蘇尼特羊、草原型藏羊、小尾寒羊、湖羊以及策勒黑羊6 個品種中均表現為低度多態(PIC<0.25)，表明2 個位點在6 個綿羊品種中的遺傳多樣性較少。前者在多羔常年發情組沒有突變型，可能由于突變致死或突變型適應性差導致死亡。從表2可知這2 個位點與綿羊季節性發情無關，因此推斷這2 個位點不是影響綿羊季節性發情的關鍵位點。與小尾寒羊產羔數關聯分析也表明，g.57842893C>T位點與小尾寒羊第1、2以及第3胎產羔數均無顯著關聯(P>0.05)，不是影響小尾寒羊產羔數的關鍵基因。

4 結 論

本研究發現，TPH1和TPH2基因在綿羊繁殖相關組織中呈中等豐度表達，在HPGA各組織中的生理功能不重疊。在蘇尼特羊中TPH1基因呈季節光照依賴性節律表達，可能參與綿羊季節性發情調控和繁殖時期轉換。TPH2基因可能在小尾寒羊下丘腦中受到E的反饋調控，參與發情時期的轉換。TPH2基因g.107854166C>T和g.107854169C>T位點不是季節性發情關鍵位點，也不參與小尾寒羊產羔數調控。