高效液相色譜法測定卡巴匹林鈣產品與反應液中尿素的含量

王瑞菲，徐婷，魏鳳，王艷，馮維春*

(1.青島科技大學山東化工研究院，濟南 250014；2.山東省化工研究院,山東省水相有機合成及高效清潔分離工程技術研究中心，濟南 250014)

卡巴匹林鈣，是“阿司匹林”(乙酰水楊酸)衍生物，是乙酰水楊酸鈣與尿素的絡合物，能夠在水中分解為乙酰水楊酸進而發揮解熱、陣痛、抗炎及抑制血小板聚集作用[1]，還可在畜牧養殖等領域中用于豬、雞、牛等各種動物的發熱和緩釋疼痛[2-3]。尿素的含量作為卡巴匹林鈣的一個重要檢測指標，其測定結果決定了產品的質量，而且在卡巴匹林鈣生產過程中，卡巴匹林鈣與卡巴匹林鈣反應液中尿素含量的測定，對于工藝和中控分析尤為重要，因此建立快速、準確的尿素含量測定方法具有重要的實際意義。卡巴匹林鈣質量標準收載于2017年獸藥質量標準目錄中(農業部公告第1433號)[4]，主要采用紫外-可見分光光度法測定尿素的含量，但是在測定過程中，受衍生試劑(對二甲氨基苯甲醛)來源、衍生的溫度等因素影響，該分析方法的重復性比較差。傳統尿素測定方法主要有高效液相色譜-熒光法[5-7]、高效液相色譜-質譜法[8-9]、分光光度法[10-11]、折光率法[12]、比色法、脲酶法[13]等分析法，檢測樣品大多為白酒、環境、罐頭食品等，存在檢測成本高、操作繁瑣、耗時長等弊端，不適用于卡巴匹林鈣反應液中尿素含量測定。高效液相色譜法快速，應用廣泛。高效液相色譜法直接測定卡巴匹林鈣中尿素含量的方法未見報道。因此，本研究利用建立的方法進行實際樣品檢測，以期測定卡巴匹林鈣以及卡巴匹林鈣反應液中尿素的含量，為優化卡巴匹林鈣的工藝路線提供技術支持以及完善卡巴匹林鈣的質量控制提供參考數據。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 高效液相色譜儀：Thermo Ultimate 3000以及配套紫外檢測器和工作站；SQP電子天平(感量0.1 mg)，德國賽多利斯天平公司；UV-2700紫外-可見分光光度儀，島津公司。

1.2 材料 甲醇、乙腈為色譜純，Thermo Fisher Scientific；其他試劑均為分析純。尿素對照品，購于中國食品藥品檢定研究院，含量為100%，批號為100288-201302。

2 方法與結果

2.1 檢測波長的選擇 取尿素對照品適量，加水溶解并稀釋成約含75 μg/mL溶液，在190～240 nm波長范圍內進行掃描。綜合考慮，本研究選擇195 nm作為檢測波長(圖1)。

圖1 尿素吸收波長光譜圖

2.2 分析方法的選擇 目前尿素的測定多采用乙腈-水體系作為流動相，由于尿素為強極性物質，在普通C18色譜柱上較難保留；在乙腈-水體系下，使用適用于強極性化合物測定的Waters Xselect HSS T3 C18色譜柱，卡巴匹林鈣中尿素色譜峰與相鄰色譜峰分離度<1.5，不符合色譜分離要求。選擇甲醇-水作為流動相體系，能夠增強尿素的保留能力。通過對不同甲醇-水比例與不同流速進行考察，選擇甲醇-水最佳比例為5∶95(V/V)且流速為0.5 mL/min，尿素峰形對稱，保留時間比較合適，分離較好。

2.3 高效液相色譜條件 色譜柱為Waters Xselect HSS T3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(5∶95，V/V)，檢測波長為195 nm，流速為0.5 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃。

2.4 尿素對照品溶液的制備 精密稱取尿素對照品80 mg，用流動相溶解并稀釋至100 mL，配制成0.8 mg/mL尿素標準儲備溶液。精密量取10 mL，加流動相稀釋至100 mL， 配制成0.08 mg/mL的尿素對照品溶液。

2.5 樣品溶液的制備 精密稱取卡巴匹林鈣0.5 g，加流動相溶解并稀釋至100 mL；精密量取10 mL，加流動相稀釋至刻度100 mL，配制成卡巴匹林鈣供試品溶液。

精密稱取卡巴匹林鈣反應液0.5 g，加流動相溶解并稀釋至100 mL，配制成卡巴匹林鈣反應液供試品溶液。

2.6 專屬性試驗 分別量取空白溶劑(流動相)、尿素對照品溶液、卡巴匹林鈣供試品溶液和卡巴匹林鈣反應液供試品溶液各10 μL，按照2.3項確定的色譜條件進行測定，試驗結果見圖2。尿素色譜峰的保留時間均約為5.59 min，尿素色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，達到基線分離，尿素的理論塔板數大于3000，表明其他組分對尿素測定無干擾。

(1為空白溶劑-流動相；2為尿素對照品溶液；3為卡巴匹林鈣供試品溶液；4為卡巴匹林鈣反應液供試品溶液)

2.7 靈敏度考察 取0.8 mg/mL尿素標準儲備液，用流動相稀釋，平行制備5份0.1 μg/mL尿素對照品溶液，供HPLC檢測，取信噪比S/N≥3時的樣品濃度為檢出限(LOD)，信噪比S/N≥10的樣品濃度為定量限(LOQ)。

添加濃度為0.1μg/mL時，信噪比S/N均大于10，信噪比滿足定量限的要求，確定本方法的定量限。添加濃度為0.05 μg/mL時，信噪比S/N均大于3，信噪比滿足檢出限的要求，確定為本方法的檢出限。

2.8 標準曲線及線性關系考察 分別量取0.8 mg/mL尿素標準儲備液適量，加流動相稀釋，配制成含尿素濃度約為0.12、16、32、48、64、80、96、120 μg/mL的標準溶液。依照濃度由小到大的順序，按照上述確定的色譜條件，以質量濃度C為橫坐標，相應的峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線。尿素標準曲線為Y=3823X-286.7，相關系數r為0.99985(圖3)。

圖3 尿素的標準曲線

2.9 儀器精密度考察 取尿素對照品溶液(80 μg/mL)，按上述色譜條件重復連續進樣6次，測得峰面積相對標準偏差為0.4%。表明此方法的儀器精密度良好(表1)。

表1 儀器精密度試驗數據

2.10 重復性考察 取卡巴匹林鈣(20181121批)與卡巴匹林鈣反應液(20181121批)，分別平行制備6份卡巴匹林鈣供試品溶液與卡巴匹林鈣反應液供試品溶液，按上述色譜條件測定尿素含量，并計算相對標準偏差(表2～表3)。結果顯示，卡巴匹林鈣重復性的RSD為0.70%，卡巴匹林鈣反應液重復性的RSD為0.92%，表明此方法的重復性符合要求。

表2 卡巴匹林鈣中尿素重復性試驗數據

表3 卡巴匹林鈣反應液中尿素重復性試驗數據

2.11 準確度考察

2.11.1 卡巴匹林鈣準確度考察 取卡巴匹林鈣(20181121批，尿素含量為重復性數據)0.25 g，分別加入尿素對照品適量，加流動相溶解，配制含尿素對照品濃度為24、32、40、48 μg/mL的供試品溶液。每個濃度水平制備5份平行供試品溶液，分別測定回收率、每個水平濃度下(組內)的RSD和所有濃度下的RSD。結果顯示，卡巴匹林鈣中尿素回收率范圍為98.10%～100.46%，組內RSD范圍為0.71%～0.93%，平均回收率為99.20%，RSD為0.75%(表4)。

2.11.2 卡巴匹林鈣反應液準確度考察 取卡巴匹林鈣反應液(20181121批，尿素含量為重復性數據)0.25 g，分別加入0.8 mg/mL尿素標準品儲備液適量，配制含尿素對照品濃度為4、20、40、64 μg/mL的供試品溶液。每個濃度水平制備5份平行供試品溶液，分別測定回收率、每個水平濃度下(組內)的RSD和所有濃度下的RSD。結果顯示，卡巴匹林鈣反應液中尿素回收率范圍為95.32%～101.20%，組內RSD范圍為0.97%～1.97%，平均回收率為98.75%，RSD為1.44%(表5)。

表4 卡巴匹林鈣中尿素回收率試驗數據

表5 卡巴匹林鈣反應液中尿素回收率試驗數據

2.12 穩定性考察 取20181201批卡巴匹林鈣與卡巴匹林鈣反應液供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、16、24 h進行測定，測得卡巴匹林鈣中尿素峰面積相對標準偏差為1.2%，卡巴匹林鈣反應液中尿素峰面積相對標準偏差為1.3%，表明供試品溶液穩定性良好。

2.13 實際樣品測定 對實驗室尿素規格13.10%的三批卡巴匹林鈣樣品分別采用本研究建立的檢測方法和紫外-可見分光光度法進行檢測，結果對比如表6所示。

表6 HPLC法與紫外可見分光光度法測定尿素含量結果比較(n=3)

通過上表數據對比發現，紫外-可見分光光度法測定的結果與本研究的高效液相色譜法相比，偏低且精度較差。

3 討論與結論

《獸藥質量標準匯編》(2017年)中尿素測定方法中衍生試劑為對二甲氨基苯甲醛，其來源不同造成的品質差異、存儲過程中易變質等問題而且衍生溫度與衍生放置時間等因素易引起數據波動，均可能對尿素分析方法的重現性和數據的精密度造成影響。另一方面，由于卡巴匹林鈣反應液中尿素濃度范圍廣，《獸藥質量標準匯編》(2017年)中尿素測定方法并不適用。

卡巴匹林反應液供試品溶液中成分復雜，且甲醇能夠加強其他有機組分的洗脫，使尿素與相鄰色譜峰分離達到色譜要求，提高分析方法的重復性。同時，流動相中含有的適量有機溶劑能夠延長色譜柱使用壽命。相比于文獻[5,14]中記載的尿素分析方法，本方法采用甲醇-水(5∶95，V/V)為流動相。與文獻[6-7]所采用的熒光檢測器與衍生測定尿素方法不同，采用紫外檢測器進行尿素含量的測定，操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬，適合卡巴匹林鈣反應液中的尿素檢測。

本研究建立了一種用于檢測卡巴匹林鈣產品及反應液中尿素含量的高效液相色譜方法；分離度R≥1.5；線性相關系數達到了0.999以上；重復性的標準偏差均小于1.0%；卡巴匹林鈣產品中尿素的回收率范圍為98.10%～100.46%，反應液中尿素的回收率范圍為95.32%～101.20%；檢出限為0.05 μg/mL。本方法具有分析時間短、靈敏度高、精確度好等優點，填補了國內空白；檢測卡巴匹林鈣產品與反應液中尿素含量，對產品生產工藝、中控分析及推廣應用均具有重要的指導意義。