H4、N2和所有亞型禽流感三重RT-PCR檢測方法的建立

羅思思，謝芝勛，李孟，黃嬌玲，李丹，謝麗基，張民秀，曾婷婷，王盛，張艷芳，范晴，謝志勤，鄧顯文

(廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西獸醫生物技術重點實驗室，南寧 530001)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV) 屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，是單股、分節段的RNA病毒，編碼8個基因(PB1、PB2、PA、HA、NA、M、NP和NS)。根據血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)抗原性的不同，目前已發現18個HA亞型和11個NA亞型[1]。部分H5和H7亞型為高致病性AIV(Highly pathogenic AIV, HPAIV)，可引起家禽大規模死亡，并可傳染給人[2]。大多數亞型AIV均為低致病性AIV(Low pathogenic AIV, LPAIV)。

H4亞型AIV屬于LPAIV，在流感調查項目中，發現H4亞型AIV常可分離到，已作為常分離出的主要亞型之一[3-5]。N2亞型AIV是最常見的NA亞型。快速檢測H4、N2和所有亞型AIV的方法對于AIV的防控具有重要意義。目前，檢測AIV的方法多為病毒分離鑒定，結果準確可靠，但存在操作步驟較多、耗時長的缺點，而在實際應用中更需要簡單、快速的檢測方法。多重PCR是在普通PCR基礎上建立起來的，即在同一反應體系中加入多對引物從而實現多個目的基因同時擴增，具有快速、簡便、成本低、可同時檢測和鑒別多種病原體等特點，已被廣泛應用于病原微生物的檢測[6-8]。本研究旨在利用多重RT-PCR技術，建立一種特異、敏感、簡便和快速檢測H4、N2和所有亞型AIV的三重RT-PCR方法。

1 材料與方法

1.1 毒株和主要試劑 不同亞型AIV(H1N1、H1N2、H3N2、H3N6、H3N8、H4N2、H4N6、H5N2、H6N2、H6N6、H7N2、H9N2)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV4)由廣西壯族自治區獸醫研究所分離保存；AIV毒株的RNA(H5N2、H7N2)由美國康涅狄格州立大學惠贈；傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus, ARV)和雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum, MG)購自中國獸醫藥品監察所。DNA/RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2購自TaKaRa公司；SPF雞胚購自北京梅里亞公司。

1.2 引物設計 在GenBank基因庫中下載H4亞型AIV HA基因、N2亞型AIV NA基因和所有亞型AIV M基因序列，應用DNAstar軟件比對序列，找出保守區域。針對保守序列，在Primer Premier 5.0軟件掌握序列片段的Tm、錯配和二聚體等信息，從而設計和篩選引物，初步篩出的引物經NCBI-BLAST模擬驗證特異性，最終得出候選引物，發至廣州Invitrogen公司合成。通過實際試驗的驗證，表1中的3對特異性引物可在同一反應體系混合使用，用于同時檢測H4、N2和所有亞型AIV。

1.3 病毒核酸提取與三重RT-PCR反應條件優化參照DNA/RNA提取試劑盒說明書，抽提病毒RNA或DNA。一步法RT-PCR反應體系25 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，H4、N2和AIV-M 三對引物終濃度在0.1～1 μmol/L之間調整，RNA 2 μL，以無RNA酶的超純水補足25 μL。反應程序如下：50 ℃ 30 min, 94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s, 50 ℃ ～ 65 ℃之間調整 40 s, 72 ℃ 40 s, 35個循環；72 ℃ 10 min。

表1 引物信息

1.4 三重RT-PCR特異性試驗 用該法對H4N2亞型AIV不同分離株、H4Ny(y≠2)亞型AIV (H4N6)、HxN2(x≠4)亞型AIV(H1N2、H3N2、H5N2、H6N2、H7N2、H9N2)、HxNy(x≠4，y≠2)亞型AIV (H1N1、H3N6、H3N8、H6N6)、NDV、IBV、ILTV、ARV、FAdV4、MG的RNA/DNA進行三重RT-PCR檢測，檢驗該法的特異性。

1.5 三重RT-PCR敏感性試驗 測定H4N2亞型AIV的RNA濃度，將RNA倍比稀釋為6 ng/μL、600 pg/μL、60 pg/μL、6 pg/μL、600 fg/μL、60 fg/μL和6 fg/μL。用該法分別對各濃度RNA進行三重RT-PCR的檢測，檢驗該法的敏感性。

1.6 三重RT-PCR臨床樣品檢測 用該法對從廣西南寧市活禽市場采集的185份咽喉和泄殖腔棉拭子樣品進行檢測。同時，將棉拭子溶液接種至9～11日齡SPF雞胚，35 ℃孵育24～120 h進行病毒增殖與分離，收集尿囊液，用血凝試驗(HA)對其進行鑒定，對有血凝性的樣品進一步用血凝抑制試驗(HI)鑒定出H亞型。對已確定H亞型的樣品，提取病毒RNA，參照文獻[9]的HA和NA基因全長引物，擴增和克隆HA和NA基因并送廣州Invitrogen公司測序。

2 結果與分析

2.1 反應條件優化結果 經過對引物之間濃度的優化，H4-F和H4-R引物終濃度為0.6 μmol/L，N2-F和N2-R引物終濃度為0.4 μmol/L，AIV-M-F和AIV-M-R引物終濃度為0.3 μmol/L。退火溫度優化結果表明,最佳退火溫度為56 ℃。

2.2 特異性結果 圖1顯示，用該法對H4N2亞型AIV的檢測出現3個目的條帶，分別為454 bp(H4亞型AIV)、282 bp(N2亞型AIV)和 167 bp(所有亞型AIV通用檢測)；對H4Ny(y≠2)亞型AIV (H4N6)檢測出現2個目的條帶，分別為454 bp和167 bp；對HxN2(x≠4)亞型AIV(H1N2、H3N2、H5N2、H6N2、H7N2和H9N2)的檢測出現2個目的條帶，分別為282 bp和167 bp；對HxNy(x≠4，y≠2)亞型AIV(H3N6、H3N8、H6N6)的檢測只有167 bp目的條帶；對常見禽病病原體(NDV、IBV、ILTV、ARV、FAdV4和MG)的檢測無擴增條帶；結果與實際相符。

M. DL1000 DNA Marker；1-3. H4N2亞型AIV不同分離株；4. H1N1；5. H1N2；6. H3N2；7. H3N6；8. H3N8；9.H4N6；10.H5N2；11. H6N2；12. H6N6；13. H7N2；14. H9N2；15.NDV；16.IBV；17.ILTV；18. ARV；19. FAdV4；20. MG；21. 陰性對照

2.3 敏感性結果 用該法對H4N2亞型AIV不同濃度的RNA進行檢測，結果見圖2。對6 ng/μL ～6 pg/μL濃度的RNA，H4、N2、AIV-M引物均能檢測到；對600 fg/μL濃度的RNA，H4、N2、AIV-M引物均檢測不到，無條帶。因此，該法至少能檢測到6 pg/μL的RNA。

2.4 臨床樣品檢測結果 用所建立的方法對185份臨床樣品進行檢測，結果見表2。有3份樣品擴增出3條特異性條帶，表明為H4N2亞型AIV；有1份樣品擴增出454 bp和167 bp的2條特異性條帶，表明為H4亞型AIV；有7份樣品擴增出282 bp和167 bp的2條特異性條帶，表明為N2亞型AIV；有8份樣品均出現167 bp的單一條帶，表明為其他亞型AIV(非H4和N2亞型)；其他166份樣品均無任何條帶，表明不是AIV。上述樣品通過病毒分離、血凝抑制試驗和進一步測序鑒定，結果與上述相符。

M: DL1000 DNA Marker；1: 6 ng/μL；2: 600 pg/μL；3: 60 pg/μL；4: 6 pg/μL；5: 600 fg/μL；6: 60 fg/μL；7: 陰性對照

表2 臨床樣品檢測結果

3 討論與結論

H4亞型AIV自1956年首次在捷克從鴨中分離出，之后廣泛分布于亞洲、歐洲和北美洲[10-12]。水禽和濱鳥是H4亞型AIV的主要宿主，并可感染海獅、馬和豬等哺乳動物[13-14]。在全球流感檢測中，H4亞型分離率較高，在野鳥中廣泛流行[15]；在我國中部、東部和南部的活禽市場廣泛傳播，并發現該亞型與其他亞型進行復雜基因重組[3-5]。有研究報道，H4N6和H9N2共感染的家禽可導致高頻的基因重組，重組病毒比野生型病毒毒力更強[16]。雖然尚未有H4致死人和導致家禽大規模死亡的案例，但根據流行調查結果，警惕我們需要定期監測該亞型的流行態勢和遺傳進化情況。H4亞型AIV在流感病毒進化中起的作用不容忽視[17]。N2亞型是主要的NA亞型，常與H1、H3、H4、H6、H9等搭配組合，H4N2是常見的組合。因此，對于目前AIV的防控，建立一種H4、N2和所有亞型AIV的檢測方法十分迫切。

本研究成功建立了H4、N2和所有亞型AIV的三重RT-PCR檢測方法，關鍵在于3對特異性引物的設計。分別針對H4、N2亞型AIV的 HA和NA基因保守序列，設計了2對型特異性引物，用于H4、N2亞型AIV的檢測；M基因在所有亞型AIV的進化中較為保守，針對M基因設計了1對型通用引物，用于所有亞型AIV的檢測。由于3對引物混合在同一反應體系使用，因此在設計引物時需考慮各擴增片段至少相差100 bp，各引物之間無非特異性反應和錯配，避免競爭性的擴增。建立的三重RT-PCR方法首先檢查是否存在AIV的感染，同時確定是否存在H4、N2亞型的感染；其次，如無H4、N2亞型AIV感染，可確定是否存在其他亞型AIV的感染，為進一步診斷提供參考依據。該法的局限性在于只能判定是否存在H4N2、H4Ny和HxN2亞型AIV的感染，并可輔助確定是否存在其他亞型AIV的感染，但無法確定是否存在混合感染的情況(H4N2與H4Ny、H4N2與HxN2、H4N2與HxNy、H4Ny與HxNy等)。

本研究通過設計和篩選3對特異性引物，優化反應條件，建立同時檢測H4、N2和所有亞型AIV的三重RT-PCR方法，具有特異性強、靈敏度高、成本低和省時省力等優點，為有效防控AIV提供技術支撐。