2019年我國部分地區鴨圓環病毒基因序列測定與分析研究

盧秀嫻，張思遠*， 梁昭平， 林舉攀，云驁，葉賀佳

(1.廣州市華南農大生物藥品有限公司，廣州，510300 2.華南農業大學，廣州，510642)

鴨圓環病毒(Duck circovirus，DuCV)屬于圓環病毒科圓環病毒屬的成員之一，是一類無囊膜、二十面體對稱的單鏈環狀最小的DNA病毒[1]，該病毒目前還不能直接進行體外分離培養，主要侵害動物免疫系統并造成免疫抑制，各日齡、品種的鴨均易感[2]，臨床癥狀表現為羽毛紊亂、生長遲緩、體況消瘦等[3]，該病毒感染后容易導致其他禽類疾病的并發或繼發感染，從而給養鴨業造成嚴重的經濟損失。

DuCV是近年來新發現畜禽病毒之一，最早于2003年由德國學者Hatterman[4]從番鴨的法氏囊組織中研究發現；2008年傅光華等首次在我國大陸地區成功克隆了鴨圓環病毒的全基因序列[5]，此后，在國內各地區鴨群中陸續檢測到DuCV的感染[6]，混合感染病例增多，近年來已經在我國大部分地區廣泛流行。

為進一步了解鴨圓環病毒在我國部分地區的感染與流行情況，了解其分子生物學特性，通過對山東、河南、江蘇、安徽等地區30份鴨圓環病毒感染的陽性病料進行鴨圓環病毒的全基因組的克隆和序列測定，對毒株的核苷酸分子特點進行分析，以期了解國內部分地區 DuCV 的流行毒株的基因型及遺傳變異情況，為鴨圓環病毒感染的防控和診斷提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2019年1月至6月，從山東、河南、江蘇等省份發病鴨場采集疑似鴨圓環病毒感染的病料30份，其發病鴨出現羽毛脫落，生長遲緩等癥狀，剖檢可見肝臟腫大，脾腫大充血、有壞死灶等。采集肝、脾、等內臟組織，-20℃保存，經華南生物動物疫病診斷中心PCR檢測均為DuCV陽性樣品。

1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒(9781)、pMD19-T載體(6013)、DL2000 DNA Marker(3427A)購自TaKaRa公司、TransStart KD Plus DNA Poiymerase(AP301-11)、購自北京全式金公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP103)、核酸染料(KP103)為天根公司產品。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理及DNA的提取 將病料組織剪碎，在研缽研磨成糊狀，按1∶5-10的比例加入滅菌PBS，反復凍融三次，7000～8000 rpm/min離心10～15 min，取上清液用TaKaRa核酸抽提試劑盒抽提基因組DNA。

1.2.2 引物設計與合成 參照 Genbank中登錄的鴨圓環病毒基因組序列，設計合成了2對擴增產物首尾相連且相互重疊的引物，用于鴨圓環病毒全基因組核苷酸的擴增，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成見表1。

表1 DuCV全基因組擴增引物序列

1.2.3 鴨圓環病毒基因組全長的PCR擴增與序列測定 以上提取的DNA為模板，用以上2對引物分別進行PCR 擴增，PCR程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共34個循環。擴增完成后，兩者PCR 產物取5 μL經1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果，PCR產物經膠回收，連接到 pMD19-T載體，轉化宿主菌DH5α感受態細胞，經培養篩選，挑取單個轉化菌落于LB培養液 (Amp+)過夜培養，PCR鑒定陽性克隆菌送至上海金唯智股份有限公司進行測序。測序結果用DNAStar，進行拼接分析。

1.2.4 DuCV全基因組序列分析 運用DNAStar和MEGA7.0將獲得的DuCV全基因序列，與GenBank參考株基因組序列比對，進行同源性比較和基因進化樹分析。本研究用于核酸序列分析參考的毒株(表2)。

表2 用于序列分析和比較的參考毒株信息

1.2.5 鴨圓環病毒Cap和Rep蛋白氨基酸序列分析 采用DNAMEND軟件預測和分析30株DuCV 的Cap蛋白抗原位點的分布情況，采用NetNG-Lyc1.0在線軟件和NetPhos 2.0軟件預測和分析Cap蛋白N-糖基化位點。

2 結 果

2.1 鴨圓環病毒全長基因組測序結果 測序結果通過應用DNAStar軟件中的SeqMan對序列進行拼接，獲得30株DuCV的全基因序列。鴨病毒基因組為環形，基因組包含4個200 bp以上的ORF，即V1(49～927 bp)、C1(1157～1930 bp)、C2(1377～1739 bp)、C3(164～400 bp)，但大多數DuCV只有2個主要的閱讀框ORF V1和ORF C1，分別編碼與病毒復制有關的Rep蛋白和核衣殼蛋白Cap 蛋白，ORF C3為新發現的可編碼引起機體的淋己損傷及細胞潤亡的閱讀框。26株DuCV的全基因序列長為1993～1995 bp，4株DuCV的全基因序列僅有1988 bp，缺失了ORF C2、ORF C3。全基因組序列存在2個與滾環復制相關的保守區域，還存在可啟動滾環復制過程中酶促反應的dNTP結合域。

2.2 鴨圓環病毒基因同源性分析 使用DNAStar軟件MegAlign對30株DuCV 基因核苷酸和氨基酸序列進行分析，毒株之間的核苷酸和氨基酸序列同源性為85.8%～99.9%，30株與其他國內外不同時間的DuCV參考毒株的全基因組序列的同源性為 83%～99.3%，與2010年之后的DuCV參考毒株同源性較高，達90%以上；26株DuCV與MH25株和YS07株等中國大陸毒株的同源性最高，核苷酸序列同源性大于96%；4株DuCV與WF0802和TC1/2002等毒株的同源性較高，核苷酸同源性為90%～97.3%左右。將30株DuCV 全基因序列與圓環病毒科中其他動物圓環病毒基因組序列進行比對發現，從不同動物中分離得到的圓環病毒, 其同源性差異比較很大。與雞圓環病毒(雞貧血病病毒CIAV)同源性最低，僅為2.4 %，與鵝圓環病毒的同源性在65%左右，與鴿子、豬等圓環病毒的同源性則為22.5 %～ 28.2 %。

2.3 鴨圓環病毒基因組的遺傳進化樹分析 采用MEGA7.0軟件對獲得的30株DuCV 全基因序列與參考毒株序列繪制基因遺傳進化樹，按現行的DuCV分型方法，根據DuCV的Cap蛋白基因在某些區域氨基酸差異較大，并以1988bp作為分界點，DuCV分為1型、2型兩個基因型[7]，分別是以德國株為代表的 DuCV-1型和以臺灣株為代表的DuCV-2型。本試驗獲得的30株DuCV序列，其中26株屬于DuCV-1型，與YS07株等中國大陸DuCV毒株的遺傳距離最近；4株為屬于DuCV-2型，則與我國大陸毒株WF080株關系較近；與其他動物圓環病毒處在不同的進化分支上，與鵝圓環病毒的親緣關系較近，其次是鴿圓環病毒(COCV)，豬圓環病毒(PCV1和PCV2)，而與雞圓環病毒(雞貧血病病毒CIAV)遺傳距離較遠。

2.4 鴨圓環病毒Cap和Rep蛋白氨基酸序列分析 對采用DNAMEND對30株DuCV 各自編碼Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列進行分析，與不同時間的DuCV參考毒株比較，Cap蛋白的氨基酸的變化區域集中在：30～64，104～124，233～238，與DuCV基因組劃分基因型序列的變異是相同的；Rep蛋白的氨基酸的變化區域則集中在：105～133，200～230，275～285。Cap蛋白構成DuCV的核衣殼，是主要的結構蛋白，存在有抗原位點及糖基化位點，通過對Cap蛋白抗原位點析，發現DuCV-1型的26株DuCV均有8個抗原表位區域，分別位于35～42、64～70、108～116、118～132、139～145、173～189、208～220和243～251；而DuCV2型的的4株DuCV則存在5個抗原表位區域，分別位于31～35、108～134、177～187、208～220、243～251；預測Cap蛋白的糖基化位點的結果與相關研究一致[8]，不同地區與基因型的DuCV分別在第206、211和231位氨基酸處存在N2糖基化位點，大部分DuCV毒株的Cap蛋白氨基酸糖基化位點在第211出現NCT→NCS和231出現NTT→NAT變動。相關研究表明，由于Cap衣殼蛋白存在可變區，即氨基酸序列的差異，用以區分基因組分型，當DuCV-1型和DuCV-2型的抗原表位及糖基化位點的氨基酸序列出現變化時，可能會造成DuCV-1型的抗原性稍強于DuCV-2型的抗原化[9]，其所受到的免疫壓力可能更大，其致病性也可能出現差異[10]。

注:▲為本試驗分離株

3 討論與結論

DuCV與其他圓環病毒屬成員一樣，常常以隱性潛伏感染存在[11]，具有免疫抑制特性和感染的持續性。當病毒入侵機體的免疫系統，導致免疫功能下降，影響機體對其他疫苗的免疫效果，抵抗病原體的能力下降，從而繼發感染其他疾病，而一旦發生混合感染，感染鴨的死亡率就會增加，特別是不同地區的DuCV的廣泛流行使我國的鴨圓環病毒疫情變得更加復雜，防控難度增大。

30株DuCV全基因序列分析結果顯示，26株DuCV的全基因序列長為1993～1995 bp，4株DuCV的全基因序列僅有1988 bp；全基因組序列的5′端均存在DuCV基因結構的特征[12]，9個保守堿基組成頂端的莖環結構，下游存在與病毒基因組滾環復制有關的2個正向的6個堿基序列。同源性比較顯示，獲得的30株DuCV全基因序列之間的同源性為83.7%～99.9%，同一基因型全基因組序列差異較小，而DuCV-1與DuCV-2兩個基因型全基因組序列之間差異較大，可達13%～16.3%；與其他國內外不同時間的DuCV參考毒株的全基因組序列的同源性比較，與2010年之后的DuCV參考毒株同源性較高；與圓環病毒科中其他動物圓環病毒基因組同源性差異比較很大。對DuCV流行毒株分子遺傳變異情況分析顯示，且兩個基因型之間差異較顯著，在遺傳進化上分為兩個明顯的分支，表明近幾年來同時流行了兩種基因型的DuCV，在全國各地均有分布，DuCV在同一年代同一區域的分離株之間的相似性比較高，有非常近的遺傳距離并聚集成簇，具有趨同進化的傾向；DuCV-1型的流行毒株與不同時間的DuCV參考毒株在遺傳進化總體上沒有明顯的分布地區和流行時間；DuCV-2型流行毒株與參考毒株在系統發育上關系接近卻又獨立分支，說明DuCV可能存在一定的變異；所有流行毒株與其他動物圓環病毒處在不同的進化分支上，親緣關系較遠。對Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列的變異分析表明Cap蛋白的變異程度要顯著高于Rep蛋白，這可能是由于Cap蛋白為病毒最主要的致病性蛋白，需要快速大量的產生變異來保證生存[13]。另外，在長期進化過程中與選擇壓力下，鴨圓環病毒的分子進化中也容易發生突變。

現有的病毒增殖體系難以增殖DuCV，對于DuCV的研究主要局限在檢測和基因組序列分析等方面[14]。對于鴨圓環病毒病在實際工作中主要以預防為主，藥物治療方法效果較差，因此需要從加強鴨群飼養管理和生物安全措施，改善養殖環境，提高鴨群對DuCV的抗病能力，防止繼發感染其他疾病。該研究對2019年上半年的DuCV流行毒株進行了遺傳變異分析，旨在為研究鴨圓環病毒分子流行病學的流行株和分布情況提供參考依據，為更好地調查和防控該病提供了科學依據。