高效液相色譜法測定微球中硫酸小檗堿的含量

朱慶賀，王麗坤，張艷，楊旭東，王爽，陳曦，王觀悅，穆永才，羅天瑤，史同瑞

(黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾161005)

硫酸小檗堿(Berberine Sulfate)是由含有小檗堿的植物中提取的一種生物堿，在黃連、黃柏、三顆針等植物中含量豐富。硫酸小檗堿具有清熱解毒、抗感染等功效[1]，與甲氧芐胺及抗菌肽等合用對大腸桿菌等細菌有協同作用[2-4]，有研究表明硫酸小檗堿對豬輪狀病毒有一定抑制作用[5]，獸醫臨床中常用于動物細菌性腸炎、各種化膿性感染的治療。載藥體系微球制劑具有高效無毒、釋藥速率恒定以及粒徑可控的優點[6]，黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院獸藥研究室結合硫酸小檗堿及微球特性制備了硫酸小檗堿微球制劑，為進一步進行硫酸小檗堿含量檢測需要，建立了微球中硫酸小檗堿含量的高效液相色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 硫酸小檗堿標準品(含量98.0%，中國食品藥品檢定研究院)；硫酸小檗堿微球制劑(規格：2%，自制)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；無水乙醇(分析純，天津市百世化工有限公司)。

1.1.2 儀器 電子分析天平，MS104TS/02型，梅特勒-托利多(上海)有限公司；高效液相色譜儀，LC-20AT SPD-20A，SHIMADZU；純水儀，XYE2-20-H型，北京湘順源科技有限公司；實驗室pH計，FE20型，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm)；注溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長349 nm；檢測器：SPD-20A；進樣量5 μL；流動相：乙腈：水(45∶55)。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 對照品溶液 精密稱取經105 ℃干燥至恒重的硫酸小檗堿對照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成98 μg/mL的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液5 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為對照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液 按照配方比例制備硫酸小檗堿微球制劑，精密取樣品適量(相當于硫酸小檗堿10 mg)，置100 mL容量瓶中，加流動相充分溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取此液1 mL置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。

1.2.2.3 陰性對照品溶液 按配方比例量取與供試品溶液相當的基質溶液(與硫酸小檗堿微球制劑相比只是不含硫酸小檗堿，其他成分相同)適量，按照供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

1.2.3 系統專屬性考察 分別取硫酸小檗堿對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按1.2.1項色譜條件進樣測定。

1.2.4 方法檢測限與定量限 取供試品溶液加流動相稀釋，分別配制成0.001，0.002，0.004，0.008和0.016 μg/mL濃度的檢測樣品溶液，按1.2.1項下色譜條件進樣測定。測得基線噪音值，按信噪比S/N≥3確定方法的檢測限(LOD)，按按信噪比S/N≥10確定方法的定量限(LOQ)。

1.2.5 線性試驗 精密量取對照品儲備液適量，分別置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度分別為0.098、0.98、4.90、24.50、49.00 μg/mL的系列對照品溶液。按1.2.1項色譜條件進樣測定，以峰面積(y)對硫酸小檗堿的濃度(x，μg/mL)進行線性回歸方程。

1.2.6 回收率測定 取1.2.2項下制備的儲備液，分別精密量取適量并添加配方劑量的空白基質，用流動相稀釋成低(L=0.98 μg/mL)、中(M=24.50 μg/mL)、高(H=49.00 μg/mL)3 種理論濃度的對照品，每個濃度配制 3 份，按1.2.1項色譜條件進樣測定，并利用外標法計算其含量。

1.2.7 精密度試驗 取1.2.2項制備的儲備液適量，用流動相稀釋成24.50 μg/mL的標準溶液，按1.2.1項色譜條件重復進樣6次，分別測定其峰面積。

1.2.8 穩定性試驗 取1.2.2項制備的儲備液適量，用流動相稀釋成24.50 μg/mL的標準溶液，按1.2.1項色譜條件分別于0、2、4、8、10、12 h測定其峰面積。

1.2.9 樣品含量測定 精密量取批號為20151101、20160125、20170607的3批次的硫酸小檗堿微球樣品適量，每批次3份，按1.2.2項制成供試品溶液，分別進行含量測定。

2 結果與分析

2.1 系統專屬性考察 分別取硫酸小檗堿對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按1.2.1項色譜條件測定，結果見圖1。在該色譜條件下，硫酸小檗堿的保留時間k為26.9 min左右，陰性對照在此時間附近沒有出峰，因此，對硫酸小檗堿HPLC的測定沒有影響，專屬性能滿足檢測要求。

2.2 方法檢測限、定量限的確定 按信噪比S/N≥3確定檢測限(LOD)，按信噪比S/N≥10確定其定量限(LOQ)。經測定，本方法對硫酸小檗堿微球制劑中硫酸小檗堿的LOD為0.001 μg/mL，LOQ為0.002 μg/mL。

2.3 線性試驗 配制0.098、0.98、4.90、24.50、49.00 μg/mL的系列對照品溶液，分別按1.2.1項色譜條件進樣測定，以峰面積(y)對硫酸小檗堿的濃度(x，μg/mL)進行線性回歸方程，得回歸方程為y=64832x+47399，R2=0.9991。結果表明硫酸小檗堿在0.098～49.00 μg/mL范圍內線性關系良好(圖2)。

圖2 硫酸小檗堿標準曲線

2.4 回收率測定 分別測定低(L=0.98 μg/mL)、中(M=24.50 μg/mL)、高(H=49.00 μg/mL)3 種理論濃度的對照品溶液的峰面積,并計算其實測濃度，結果表明高、中、低濃度對照品溶液中硫酸小檗堿的平均回收率為98.98%，該方法回收率符合要求(表1)。

表1 硫酸小檗堿的回收率

回收率R% = 實測濃度/理論濃度 × 100%

2.5 精密度試驗 制備得24.50 μg/mL的標準溶液，按1.2.1項色譜條件重復進樣6次，測定其峰面積分別為1849872、1796579、1846351、1860479、1851674、1847562。計算RSD為1.24%，表明精密度良好。

2.6 穩定性試驗 制備得24.50 μg/mL的標準溶液，按1.2.1項色譜條件分別于0、2、4、8、10、12 h測定其峰面積分別為1849852、1896754、1846851、1861456、1844598、1857562，平均峰面積為1859512，RSD為1.04%，表明樣品在12 h內含量穩定。

2.7 樣品含量測定 批號為20151101、20160125、20170607的3批樣品中硫酸小檗堿平均含量分別為標示量的98.18%、101.41%、103.29%，符合規定。

3 討論與結論

3.1 色譜條件 應用二級陣列檢測器對對照品溶液在200～400 nm波長范圍內進行掃描得知，硫酸小檗堿標準品溶液在229、349 nm處有最大吸收峰，另外，參考文獻報道[7-9]得知，小檗堿在349 nm為常用紫外測定波長。因此,選擇349 nm波長下測定硫酸小檗堿微球制劑中硫酸小檗堿的含量。通過色譜結果的比較分析，在349 nm波長下測定，能夠獲得最大的靈敏度和抗干擾能力，本試驗中選擇349 nm作為硫酸小檗堿含量的檢測波長。試驗中比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀溶液作為流動相的分離效果，結果表明，乙腈-水在經過比例調試(45∶55)后分離效果最好，分離得到的硫酸小檗堿峰型良好，無拖尾現象，分離度大，因此,選擇乙腈-水(45∶55)為檢測流動相。

3.2 小檗堿的含量檢測方法 小檗堿的主要成鹽形式包括鹽酸鹽和硫酸鹽，鹽酸小檗堿作為臨床中常用中藥成分，研究較多。而硫酸小檗堿在獸醫臨床領域，尤其是制劑含量檢測方面文獻較少。因此，建立硫酸小檗堿的含量檢測方法對于硫酸小檗堿的藥物規范化應用具有重要意義。李華芩[10]等首先利用分光光度計法建立了注射液中硫酸小檗堿含量檢測方法，該方法適用于企業進行產品的質量控制。之后又利用HPLC建立了注射液中硫酸小檗堿的含量檢測方法，但由于未購得硫酸小檗堿標準品，所以用鹽酸小檗堿標準品進行代替[7]。本研究因劑型優化，制備了硫酸小檗堿微球制劑，但尚無微球制劑中硫酸小檗堿的含量檢測方法，因此,本試驗利用HPLC建立了微球中硫酸小檗堿的含量檢測方法，為以后硫酸小檗堿微球制劑的含量檢測提供技術支持。

本實驗室成功研制了硫酸小檗堿微球制劑，兼具了硫酸小檗堿和微球制劑的共同優點，是獸醫臨床中一種良好的長效緩釋劑型[6]。為了這一新劑型的更好應用，建立了硫酸小檗堿的HPLC檢測方法，本方法分離度好，硫酸小檗堿的保留時間在26.9 min左右，峰形好，基本無拖尾，雜質不干擾實驗測定，而且采用外標法測定硫酸小檗堿微球的含量操作簡單，結果準確，回收率高，重現性好，可以為微球中硫酸小檗堿含量的檢測提供參考。