高效體積排阻色譜檢測(cè)口蹄疫滅活疫苗中146S抗原含量的疫苗破乳方法比較

徐 嫄，王 兆，朱元源，李 翠，鄒興啟，朱利敏，萬建青，王 琴，郎洪武，夏應(yīng)菊，徐 璐，張乾義，趙啟祖

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所, 北京 100081)

口蹄疫(foot-and-mouth disesase,FMD)是一種由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disesase virus，F(xiàn)MDV)引起的可以對(duì)家畜造成非常嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的疫病，我國目前通過注射滅活疫苗來控制該病的流行。口蹄疫病毒完整病毒粒子在蔗糖密度梯度中的相對(duì)沉降系數(shù)為146S，分子量為8.08×106u，在酸性、堿性或一定溫度條件下降解為12S和5S粒子，失去免疫原性[1]。因此口蹄疫滅活疫苗中146S抗原的含量直接關(guān)系到疫苗的免疫效果。已有研究表明，高效體積排阻色譜技術(shù)(High Performance Size Exclusion Chromatography，HPSEC)在口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)過程中，可應(yīng)用于病毒顆粒的檢測(cè)[2-4]。在前期的研究中，我們已經(jīng)建立了口蹄疫滅活疫苗中146S抗原含量的HPSEC檢測(cè)法[5]，并開展優(yōu)化研究，進(jìn)一步提高了方法的準(zhǔn)確性和可靠性[6]。該方法使用正戊醇對(duì)雙相油乳劑口蹄疫滅活疫苗進(jìn)行破乳，用核酸酶處理破乳得到的水相以去除干擾，最后通過HPSEC檢測(cè)水相中的146S抗原。由于色譜檢測(cè)的是疫苗破乳后的水相部分，因此破乳的可操作性和有效性，以及對(duì)保持破乳水相中146S抗原的穩(wěn)定性都是至關(guān)重要的。前期試驗(yàn)中使用正戊醇對(duì)疫苗進(jìn)行破乳，取得了良好的效果，但仍存在不同生產(chǎn)企業(yè)的疫苗破乳水相體積存在差異，操作方法較為復(fù)雜等問題。本研究分別使用正戊醇、正丁醇、三氯甲烷對(duì)9批2019年監(jiān)督抽檢的口蹄疫滅活疫苗樣品進(jìn)行破乳，通過比較破乳后水相體積和146S抗原HPSEC檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)最優(yōu)的破乳方法，進(jìn)一步提高146S抗原檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和方法的適用性。

1 材料與方法

1.1 儀器 2010A型高效液相色譜儀(島津公司)，L203型電子天平(梅特勒-托利多)，CF16X型離心機(jī)(HITACHI)，純水機(jī)(MiliQ)，生物安全柜(NUAIRE)，PHSJ-4F型pH計(jì)(雷磁)，單道移液器(eppendorf)，TS-1搖床(Qilinbeier)。

1.2 試劑與材料 無水硫酸鈉、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、正戊醇、正丁醇、三氯甲烷、氯化鈉，國藥集團(tuán)(分析純)；Benzonase核酸酶，Sigma公司；口蹄疫滅活病毒顆粒(146S抗原)標(biāo)準(zhǔn)品由中國科學(xué)院過程工程研究所制備；9批口蹄疫滅活疫苗為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所2019年監(jiān)督檢驗(yàn)留樣。

1.3 色譜條件 色譜柱：TSKgel G4000SWXL(7.8 mm×30 cm)色譜柱(TOSOH)；流動(dòng)相：稱取磷酸氫二鈉15 g，磷酸二氫鈉1.25 g，無水硫酸鈉14.2 g，加水定容至1 L；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長：259 nm；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：100 μL。

1.4 疫苗前處理 每批疫苗采用不同的有機(jī)試劑處理,分別重復(fù)3份。正戊醇和正丁醇前處理操作方法：取9 mL疫苗，1 mL正戊醇或正丁醇，加入15 mL離心管，上下劇烈振蕩離心管5 min使疫苗破乳，4 ℃靜置1 h使分層，將離心管置于冰上，緩慢吸取上層有機(jī)相棄去，緩慢吸取底層水相200 μL轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，加入0.5 μL Benzonase核酸酶，吹打混勻，置搖床振搖，室溫反應(yīng)1 h。三氯甲烷前處理操作方法：取6 mL疫苗和6 mL三氯甲烷加入15 mL離心管，上下劇烈振蕩離心管5 min使疫苗破乳，4 ℃ 4000 r/min離心10 min，緩慢吸取上層水相200 μL轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，加入0.5 μL Benzonase核酸酶，吹打混勻，置搖床振搖，室溫反應(yīng)1 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性回歸方程 口蹄疫滅活病毒顆粒(146S抗原)標(biāo)準(zhǔn)品建立線性回歸方程為y=64409x-80431，R2=0.9981，線性關(guān)系良好(圖1)。

圖1 口蹄疫滅活病毒顆粒146S標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 破乳水相得率 使用正戊醇、正丁醇分別破乳疫苗靜置分層后水相在底層，使用三氯甲烷破乳疫苗離心后水相在頂層，以1號(hào)疫苗為例分層結(jié)果見圖2；9批疫苗的破乳水相得率見表1。

2.3 色譜結(jié)果 9批疫苗的色譜結(jié)果以三氯甲烷前處理后單次檢測(cè)色譜圖結(jié)果為例，見圖3。

A.正戊醇；B. 正丁醇；C. 三氯甲烷A.n-amyl alcohol; B. n-butanol; C. trichloromethane

表1 9批疫苗三種前處理方法的破乳水相得率

圖3 三氯甲烷前處理9批疫苗單次HPSEC檢測(cè)色譜圖

2.4 146S抗原含量檢測(cè)結(jié)果 將146S峰面積代入線性回歸方程計(jì)算得破乳水相中146S抗原含量，再乘以水相得率計(jì)算得疫苗中146S抗原含量(表2)。

表2 9批疫苗HPSEC檢測(cè)結(jié)果

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果 分別對(duì)三種不同前處理方法檢測(cè)9批疫苗的均值應(yīng)用SAS9.2軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)；單因素方差分析表明，三種方法的檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異(表4)。

表3 SAS9.2軟件分析結(jié)果

表4 單因素方差分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

在前期的實(shí)驗(yàn)室研究階段，將口蹄疫抗原濃縮液用PBS稀釋成不同濃度后，與ISA206油佐劑等體積混合，使用正戊醇對(duì)口蹄疫疫苗進(jìn)行破乳，破乳水相得率為46%[5,7]。但在疫苗樣品的檢測(cè)中卻發(fā)現(xiàn)，即使各生產(chǎn)企業(yè)均以等體積水相和有機(jī)相配苗，但并非每批疫苗都能達(dá)到46%的水相得率，因此檢測(cè)過程中需要同時(shí)測(cè)量水相體積。另一方面，使用正戊醇破乳后，由于水相在底層，導(dǎo)致取樣過程極易混入有機(jī)相。以上兩方面因素不僅增加了操作難度，而且易導(dǎo)致油相進(jìn)入色譜系統(tǒng)，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。針對(duì)以上問題，我們對(duì)破乳方法進(jìn)行了研究，通過比較正戊醇、正丁醇、三氯甲烷這三種破乳試劑在9批疫苗產(chǎn)品的146S含量檢測(cè)中的破乳水相得率、檢測(cè)結(jié)果的差異，以及可操作性，進(jìn)行破乳方法的比較和優(yōu)化。結(jié)果表明，使用三氯甲烷對(duì)9批疫苗破乳后得到的水相體積最大，并且數(shù)值穩(wěn)定，9批疫苗水相得率均為50%；另外兩種有機(jī)試劑的水相提取率則相對(duì)較低，且數(shù)值不穩(wěn)定。應(yīng)用SAS9.2軟件對(duì)三組146S檢測(cè)結(jié)果的分析表明，三組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；單因素方差分析表明，三組數(shù)據(jù)無顯著性差異，其中三氯甲烷組和正戊醇組的結(jié)果一致性強(qiáng)，正丁醇組數(shù)據(jù)普遍偏低。使用三氯甲烷進(jìn)行破乳時(shí)，可以通過離心處理加快分層速度，并且破乳后水相在上層，便于取樣，降低了操作難度。正戊醇和正丁醇的使用量低于三氯甲烷，對(duì)相同體積的疫苗進(jìn)行破乳處理，正戊醇和正丁醇僅需要疫苗體積的1/9，使用三氯甲烷則需要與疫苗體積相等才能達(dá)到有效破乳。但HPSEC檢測(cè)具有樣品用量少的優(yōu)點(diǎn)，由于三氯甲烷前處理的破乳水相得率穩(wěn)定，則不需要對(duì)樣品進(jìn)行大量破乳用以測(cè)量水相體積，從而避免三氯甲烷的大量使用。

綜上所述，在應(yīng)用HPSEC對(duì)口蹄疫滅活疫苗中的146S抗原含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，使用三氯甲烷對(duì)疫苗進(jìn)行破乳，不僅檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，而且操作簡便快速，是更為理想的破乳試劑。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)破乳方法的研究，改進(jìn)了口蹄疫滅活疫苗中146S抗原含量的HPSEC檢測(cè)方法。應(yīng)用HPSEC檢測(cè)口蹄疫滅活疫苗中的146S抗原含量，不僅符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R原則，而且能夠解決當(dāng)前面臨的檢驗(yàn)用陰性動(dòng)物供應(yīng)困難、檢驗(yàn)成本過高等問題。該方法有望成為效力檢驗(yàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法，為提高我國口蹄疫滅活疫苗的研制水平和疫病的防控提供有力技術(shù)支持。