百里醌對HUVECs細胞凋亡的影響及其機制

周瑜 李家富 馮健

(西南醫科大學附屬醫院心內科，四川 瀘州 646000)

動脈粥樣硬化(AS) 是缺血性心血管疾病的主要病理基礎，是導致死亡的主要疾病之一〔1〕。血管內皮細胞凋亡的發生和AS及血栓形成存在密切聯系〔2〕，研究發現自噬在心血管凋亡中發揮重要功能，自噬功能受損時垃圾蛋白和缺陷性細胞器持續性積累導致細胞凋亡發生〔3，4〕。百里醌能通過抗凋亡和抗氧化應激保護嗎啡對腎臟的毒害作用〔5〕，前期研究表明百里醌能夠激活鱗狀細胞癌自噬〔6〕，本研究旨在證實百里醌通過調節自噬參與對心血管疾病的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)購于中國科學院昆明細胞庫。DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Gibco公司。百里醌、過氧化氫和選擇性磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制劑(3-MA)購自美國Sigma-Aldrich公司，自噬雙標腺病毒(GFP-LC3)購自上海吉凱基因化學技術有限公司，膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶雙標記細胞凋亡檢測試劑盒購自廣州達博生物有限公司，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化(p)-Akt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR、人抑癌基因(Beclin1)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3/活化的(Cleaved)Caspase-3購自美國CST公司，自噬相關基因(LC3)-Ⅰ/LC3-Ⅱ購自美國abcam公司，β-actin抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2細胞培養 HUVECs培養于含10%胎牛血清的DMED培養基，加入100 μg/ml青霉素和鏈霉素(Sigma，USA)，置于37℃、5%CO2的培養箱內。每2～3 d換液，每4～5 d胰蛋白酶消化離心后傳代。使用百里醌處理HUVECs細胞24 h，然后加入800 μmol/L過氧化氫處理1 h。根據百里醌濃度的不同將細胞分為四組，即陰性組(不加百里醌及過氧化氫)、對照組(800 μmol/L 過氧化氫)、低濃度組(10 μmol/L百里醌+800 μmol/L 過氧化氫)及高濃度組(20 μmol/L百里醌+800 μmol/L過氧化氫)；研究自噬作用時使用3-MA(1 mmol/L)和百里醌(20 μmol/L)與HUVECs細胞共培養24 h，加入800 μmol/L過氧化氫處理1 h，收集細胞備后續檢測，根據處理方式的不同將細胞分為：對照組(800 μmol/L過氧化氫)；陰性組(不加百里醌及過氧化氫)；百里醌組(20 μmol/L百里醌+800 μmol/L 過氧化氫)；3-MA組(1 mmol/L 3-MA+800 μmol/L 過氧化氫)；聯合組(20 μmol/L百里醌+1 mmol/L 3-MA+800 μmol/L 過氧化氫)。

1.3四甲基偶氮唑藍(MTT)方法檢測細胞增殖能力 將生長到對數期的HUVECs細胞用0.25%胰蛋白酶消化收集于離心管，用4 ml含10%胎牛血清培養基制成細胞懸液并細胞計數，按每孔8 000個細胞接種于96孔板，每孔200 μl置于37℃、5%CO2培養箱24 h，去掉上清液，陰性組、對照組、低濃度組、高濃度組均設置5個副孔，去上清液，每孔加入含10% MTT液的DMEM培養基200 μl，再次置入37℃、5%CO2培養箱培養4 h。去上清液，每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，搖床上低速振蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀(OD=490 nm)處測定各孔的OD值，做出細胞生長曲線。

1.4GFP-LC3熒光檢測細胞自噬水平 GFP-LC3預實驗感染確定HUVECs細胞感染復數(MOI)值為50，調整細胞密度將HUVECs細胞接種于6孔板中，轉染前用DMEM培養液清洗細胞，使用完全培養基稀釋聚凝胺至終濃度50 μg/ml，細胞加入5 μg/ml的聚凝胺和相應體積病毒轉染HUVECs細胞，熒光顯微鏡下檢測熒光蛋白表達。胰酶消化離心，調整細胞密度為20×104/ml，24孔板中加入細胞爬片，每孔加入2×104細胞，放置于培養箱中培養至細胞貼壁，按1.2方法處理細胞，取出爬片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入4%多聚甲醛固定，PBS清洗后加入DAPI染色，應用封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞爬片。

1.5流式細胞儀分析細胞凋亡 6孔板接種細胞，每孔接種1×105細胞培養過夜，按1.2方法處理細胞，胰酶消化離心收集細胞，800 r/min離心5 min并用PBS清洗細胞2次，加入250 μl結合緩沖液重懸細胞，調節細胞濃度為1×106/ml，取100 μl細胞懸液放置于5 ml流式管中，管內加入5 μl Annexin V-FITC(150 mg/L)和10 μl碘化丙錠(120 mg/L)并混勻，室溫條件下避光孵育15 min，加入400 μl PBS，應用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.6Western印跡檢測相關蛋白表達 細胞胰蛋白酶消化離心后傳代，種于6孔板內，待細胞貼壁后按1.2方法處理細胞。取出并棄去上清，用PBS沖洗3次加入細胞裂解液，冰上靜置1 min后刮下裂解物并轉移至1.5 ml離心管，震蕩混勻30 s，冰上靜置10 min，4℃、15 000 r/min離心15 min，提取上清總蛋白。留取5 μl定量，其余加入6×上樣緩沖液(1∶5體積比)后在沸水中煮沸5 min變性。取30 μg蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，用110 V電壓2 h將凝膠上的蛋白轉至硝酸纖維素(NC)膜上。50 g/L脫脂奶粉將膜封閉1 h后，將膜置于特定一抗，4℃搖床上孵育過夜。次日使用TBST洗膜液10 min/次洗3次并置于相應的二抗，常溫搖床慢速孵育1 h，10 min/次洗3次后使用電化學發光(ECL)顯影液進行顯影，目的蛋白表達量通過與內參蛋白β-actin標準化后得到相對比值。

1.7統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1百里醌降低過氧化氫引起的HUVECs細胞凋亡 對照組細胞存活率顯著低于陰性組(P<0.05)，百里醌預處理可以提高細胞存活率，并隨藥物濃度加大而增強，呈現出濃度依賴性關系(P<0.05)；百里醌預處理后Cleaved Caspase-3蛋白水平較對照組顯著下調(P<0.05)；百里醌預處理可以降低由過氧化氫引起的HUVECs細胞凋亡(P<0.05)。見圖1、表1、圖2。

2.2百里醌激活HUVECs細胞自噬 低、高濃度組LC3蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05)；低、高濃度組GFP-LC3蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)；見表1、圖3、圖4。

1～4：陰性組、對照組、低濃度組、高濃度組；圖3、6、7同

表1 各組細胞存活率、細胞凋亡率和Caspase-3、Cleaved Caspase-3、LC3蛋白表達及GFP-LC3比較

與陰性組比較：1)P<0.05;與對照組比較：2)P<0.05;與低濃度組比較：3)P<0.05

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡

圖3 Western印跡法檢測LC3蛋白表達

圖4 百里醌激活HUVECs細胞自噬(DAPI，×200)

2.3阻斷自噬途徑百里醌對HUVECs細胞保護作用減弱 10 μmol/L和20 μmol/L百里醌預處理細胞后加入過氧化氫，應用MTT方法檢測細胞存活率分別為(47.673±0.976)%和(68.783±7.569)%。加入3-MA阻斷自噬途徑，再使用百里醌和過氧化氫處理細胞，細胞存活率分別為(23.099±2.801)%和(34.563±3.018)%，差異具有統計學意義(F=43.198，P=0.000)，發現阻斷自噬后百里醌保護作用減弱(P<0.05)。使用Western印跡檢測Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白水平變化，結果顯示阻斷自噬后Cleaved Caspase-3蛋白水平上調且加入百里醌預處理并不能導致Cleaved Caspase-3蛋白水平下調。見圖5、表2。

1～5：對照組、陰性組、百里醌組、3-MA組、聯合組

表2 不同組別間Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達

2.4百里醌抑制Akt/mTOR通路和上調Beclin1蛋白激活自噬，促進Bcl-2蛋白表達抑制凋亡 與對照組相比發現百里醌下調p-Akt和p-mTOR蛋白表達，上調Beclin1和Bcl-2蛋白表達。見圖6、圖7、表3。

圖7 Western印跡檢測Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達

表3 各組Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Beclin1、Bcl-2蛋白表達

3 討 論

冠狀動脈性疾病是當今社會導致死亡的主要疾病之一，凋亡在動脈粥樣硬化性疾病發展過程中起到重要作用，研究發現動脈粥樣硬化組織和細胞中凋亡分子指標明顯升高〔7，8〕。自噬作為保護機制，通過降解垃圾蛋白和缺陷性細胞器對抗細胞凋亡，然而在心血管疾病中自噬和凋亡之間的相關性仍不清楚。本研究發現百里醌降低過氧化氫引起的HUVECs細胞凋亡。MTT結果顯示百里醌預處理后加入過氧化氫能夠提高細胞生存率。Western印跡檢測凋亡蛋白Caspase-3、Cleaved Caspase-3表達和Annexin V-PI雙染是觀察細胞凋亡的常用方法，本研究發現800 μmol/L過氧化氫導致HUVECs細胞凋亡，而百里醌預處理后再加入過氧化氫處理細胞凋亡減少。此外，Annexin V-PI雙染可以將凋亡細胞分為早期凋亡和晚期凋亡，早期細胞凋亡的發生主要由于線粒體膜電位的變化和丟失，而晚期凋亡通常與DNA損傷有關，本研究發現百里醌主要減少晚期凋亡細胞百分比，而對早期凋亡細胞影響較小，具體機制尚未可知。

為了研究自噬在百里醌保護作用中發揮的功能，本研究檢測自噬標記物LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白表達。自噬發生過程中，LC3耦聯到自噬體上并LC3-Ⅰ轉換成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ蛋白和LC3-Ⅰ蛋白比值變化已被用來作為自噬評價和測定的公認指標〔9〕。本研究發現百里醌處理后LC3-Ⅱ蛋白水平升高，表明百里醌激活HUVECs細胞自噬的發生。同時本研究應用GFP-LC3病毒檢測百里醌對自噬的影響，無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞質中，自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，通過計數來評價自噬活性的高低。本研究中使用百里醌處理GFP-LC3腺病毒感染的HUVECs細胞發現綠色熒光斑點數增加，提示細胞自噬水平升高。同時為了驗證自噬是否參與百里醌降低過氧化氫引起的HUVECs細胞凋亡過程，采用3-MA阻斷自噬發生后觀察細胞增殖和凋亡情況改變，MTT結果顯示阻斷自噬后百里醌保護作用減弱，同時Western印跡結果顯示阻斷自噬后Cleaved Caspase-3蛋白水平升高，表明自噬在此保護作用中發揮了重要功能。

此外，百里醌激活自噬的分子機制也是本研究的重點，既往研究發現百里醌通過抑制p-mTOR激活自噬，mTOR是自噬通路的經典負性調節蛋白。在動脈粥樣硬化發生過程中，常常伴隨著mTOR信號通路激活導致的自噬下調〔10〕。因此假設百里醌在HUVECs細胞系中通過Akt/mTOR信號通路調節自噬。使用Western印跡實驗檢測百里醌處理后p-Akt和p-mTOR蛋白改變，結果顯示百里醌可以抑制p-Akt和p-mTOR蛋白水平。關鍵性自噬調節蛋白Beclin1同凋亡途徑存在著明顯聯系〔11〕，同時Beclin1-Bcl-2復合體是自噬和凋亡相互作用的關鍵調節因子，本研究中發現百里醌上調Beclin1和Bcl-2蛋白表達，表明百里醌可能通過上調Beclin1激活自噬并通過上調Bcl-2發揮抗凋亡功能。

百里醌作為植物提取物，在抗腫瘤方面發揮重要功能，本研究中首次提出百里醌通過激活自噬保護血管內皮細胞發揮抗凋亡功能，對于心血管疾病的治療提供了新的思路，在未來心血管疾病治療過程中可能發揮重要作用。