內異方對子宮內膜異位癥模型大鼠核因子-κB信號通路相關因子的影響

宋曉婕 周艷艷 趙莉娜

(河南省中醫院 河南中醫藥大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450002)

子宮內膜異位癥(EM)是常見的婦科良性疾病，是由本該長在子宮腔的內膜細胞通過輸卵管進入盆腔異位生長引發的，以疼痛、進行性加重盆腔粘連和不孕為主要臨床表現的一類疾病，給女性的生理和心理帶來極大負擔〔1〕。目前關于子EM的發病機制是臨床研究熱點之一，核因子(NF)-κB參與細胞免疫、應激和凋亡的調節，在EM的發生、進展中扮演著重要角色〔2〕。內異方是針對EM行氣化瘀，軟堅消癥的經驗藥方〔3〕，本文為探討內異方治療EM對NF-κB信號通路的影響，對EM模型大鼠采用內異方干預15 d后進行相關mRNA、蛋白表達和血清因子檢測。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取無特定病原體級雌性成熟未孕SD大鼠(由廣東醫學實驗動物中心提供)80只，大鼠體重為200～300 g，鼠齡為7～10 w。實驗動物的處理按照醫學動物倫理相關規定〔4〕給予人道主義關懷，給予自由飲水和飲食，室內溫度設置為22℃，濕度50%，每天12 h光照。

1.2藥物配制 孕三烯酮(華潤紫竹藥業有限公司，國藥準字H19980020，規格：2.5 mg×8粒/盒)，去除外部膠囊后，將粉末溶于蒸餾水混勻，配制成濃度為0.032 mg/ml的孕三烯酮混懸液，置于4℃冰箱備用。內異方(由炒當歸、丹參、赤芍、制香附、血竭、川牛膝等12味中藥構成，共100.5 g)是由河南省中醫院中藥房提供，用蒸餾水洗凈，煎煮，過濾和濃縮為3.58 g/ml藥液，冷卻后置于4℃冰箱備用。

1.3建模 將80只大鼠隨機分為空白對照組、模型組、內異方組和孕三烯酮組，每組20只，除空白對照組外，將其余3組大鼠自體子宮內膜移植于腸系膜上建立 EM大鼠模型，具體方法為：術前2 d肌內注射4 mg/2 ml的苯甲酸雌二醇(天津金耀藥業有限公司，國藥準字H12020529，規格：1 ml∶1 mg)，使大鼠處于相同動情周期，禁食12 d后，超凈臺內操作大鼠，采用水合氯醛(10%自配滅菌)行腹腔麻醉，開腹后找到子宮，游離左側子宮行結扎后切除1 cm長度的子宮段放入無菌生理鹽水中，切割成4片后縫合在右側腸系膜血管豐富處，腹腔留置青霉素鈉(廣州白云山天心制藥，國藥準字H44022448，規格160 IU×20瓶)0.25 ml，縫合腹腔壁，分籠飼養。術后3 d連續每天1次注射青霉素鈉0.25 ml，術后第2天肌內注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg。

1.4分組給藥 空白對照組與模型組給予0.2 ml生理鹽水，每天1次灌胃，內異方組根據大鼠體重給予配置好的內異方藥液35.88 g/kg，每天1次灌胃，孕三烯酮組根據大鼠體重給予孕三烯酮備用混懸液0.325 mg/kg，每周2次灌胃，4組均連續干預15 d。

1.5觀察和檢測指標 藥物干預結束后，對大鼠采血，分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清學指標：白細胞介素(IL)-6、IL-1b、腫瘤壞死因子(TNF)-α、神經生長因子(NGF)和血管內皮生長因子(VEGF)。處死大鼠后開腹，觀察比較建模3組內異灶數目和體積，并對盆腔粘連程度進行評分〔1〕：粘連面積<25%計為1分，25%≤粘連面積<50%計為2分，粘連面積≥50%計為3分；粘連程度疏松、無血管粘連計為1分，致密粘連、血管粘連計為2分，無組織界面粘連計為3分；無卵巢粘連計為0分，卵巢單側粘連計為1分，卵巢雙側粘連計為2分。以粘連面積、粘連程度和卵巢粘連3個方面分數相加計為粘連評分。

取建模3組EM病灶附著點周圍腹膜組織，空白對照組留取盆腔正常腹膜組織，生理鹽水清洗后，將每塊組織分為2份。1份組織采用免疫組化的方法檢測組織中NF-κB、NF-κB抑制因子(IκB)和IκBs激酶(IκK)的蛋白相對表達量，另一份采用反轉錄酶-聚合酶鏈式擴增反應(RT-PCR)測定NF-κB、IκB和IκK的mRNA定量。

1.6統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.13組建模大鼠給藥后盆腔內異灶數目、體積和粘連程度評分比較 給藥干預15 d后內異方組和孕三烯酮組盆腔粘連評分、內異灶數目和體積明顯小于模型組(P<0.05)，內異方組與孕三烯酮組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.24組給藥后IκK、IκB、NF-κB mRNA表達量比較 與空白對照組相比，其余3組腹腔組織IκK和NF-κB mRNA的含量明顯升高，IκB mRNA含量顯著降低(均P<0.05)；與模型組相比，孕三烯酮組與內異方組IκK和NF-κB mRNA含量均明顯降低，而IκB mRNA含量明顯升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)；內異方組對三種 mRNA含量的改善程度明顯優于孕三烯酮組(P<0.05)。見表2。

表1 3組建模大鼠給藥后盆腔內異灶數目、體積粘連評分比較

與模型組比較:1)P<0.05

表2 4組給藥后IκK、IκB、NF-κB mRNA表達量比較

與空白對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與孕三烯酮組比較:3)P<0.05；下表同

2.34組給藥后IκK、IκB、NF-κB 蛋白表達水平比較 與空白對照組相比，其余3組腹腔組織IκK和NF-κB蛋白表達水平明顯升高，IκB 蛋白表達水平顯著降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)；與模型組相比，孕三烯酮組與內異方組IκK和NF-κB蛋白表達量均明顯減少，而IκB蛋白的表達水平增加，差異均有統計學意義(均P<0.05)；內異方組對三種蛋白表達水平的改善程度明顯優于孕三烯酮組(P<0.05)。見表3。

2.44組給藥后血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF比較 與空白對照組相比，模型組血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF水平明顯升高(P<0.05)；孕三烯酮組與內異方組血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF水平明顯低于模型組(P<0.05)，內異方組上述血清指標改善程度均顯著優于孕三烯酮組(P>0.05)。見表4。

表4 4組給藥后血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF水平比較

3 討 論

西醫在治療EM主要采用手術和激素類藥物，存在一定局限性，難以根治。中醫目前主要用于EM的保守治療或結合西醫的輔助治療，本研究采用的內異方是根據蔡莊治療EM加以總結而來的經驗方，采用血竭破除積血，生心血，海藻、炙甲片活血、軟堅散結，皂角刺、川牛膝、赤芍、丹參、桂枝活血祛瘀，炒當歸、制香附調經止痛，干漆消散癥瘕，諸藥配伍合奏行氣破瘀、軟堅消癥功效〔5～7〕。

NF-κB是一種蛋白復合物，幾乎存在于所有動物細胞中，參與細胞應激、免疫和凋亡等過程的調節，已有研究表明NF-κB在EM患者中表達異常，是EM重要的病因學因素之一〔8,9〕。本研究結果顯示IκB能抑制NF-κB的表達，而IκK則通過使IκB的N端亞基磷酸化從而被降解，降低NF-κB活性及表達，并促使相關促炎因子表達與分泌下調〔10〕。本研究結果說明內異方和孕三烯酮都能抑制內異灶生長，降低盆腔粘連程度。內異方如前面提到的具有活血軟堅功效，孕三烯酮屬于雄激素衍生物，有抗孕激素、雌激素和性腺激素的效果，由于EM具有雌激素依賴性，孕三烯酮能通過降低雌激素水平使其萎縮，達到治療效果〔11,12〕。內異方組改善幅度高于孕三烯酮組，提示內異方可能通過抑制IκK和上調IκB基因的表達，來抑制NF-κB蛋白的合成發揮其療效，而孕三烯酮對NF-κB的調節作用沒有內異方顯著。

異位子宮內膜細胞NF-κB被激活，可以促進巨噬細胞釋放促炎因子IL-6、IL-1b，同時NF-κB又是VEGF基因啟動中的關鍵調控因子，它正向調節VEGF從而促進血管生成，血管生成常伴隨了神經的生長，NGF是介導異位子宮內膜神經生長的重要因子，NGF水平相應升高，進一步導致EM病變發生和進展〔13,14〕。本研究提示，孕三烯酮組直接改善大鼠血清學指標，而內異方能通過NF-κB信號通路下調血清炎性因子和血管神經相關因子水平從而降低大鼠體內炎癥水平〔15〕。