螺旋藻激酶抗血管內皮細胞氧化損傷與一氧化氮的相關性

楊曉梅 陳萌 龐輝 趙杰 王慧杰 韋嬌

(廣西醫科大學基礎醫學院，廣西 南寧 530021)

心腦血管疾病的致病因素是血管損傷和血栓形成，它們的起始環節是血管內皮細胞損傷，而氧化應激、慢性炎癥被公認是血管內皮損傷發生發展的重要因素，因此，尋找抗氧化、抗炎等綜合療效高的內皮細胞保護藥物，對預防心腦血管疾病有重要的臨床價值〔1〕。一氧化氮(NO)是在體內由一氧化氮合酶(NOS)催化產生的產物，它能清除氧自由基，是抗氧化的內皮細胞保護因素，它的含量變化與心血管疾病的發生發展密切關聯〔2〕。螺旋藻(Spirulina) 為原核生物，具有豐富的營養價值，發酵酶化后獲得一種蛋白激酶，稱為螺旋藻激酶(SPK)。SPK具有防止血液凝固和溶解血栓的作用，它可以預防血栓性疾病，并且其作用與調節內皮細胞功能有關。SPK可降低氧化應激時過氧化產物丙二醛(MDA)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性〔2～5〕。本實驗擬通過過氧化氫(H2O2)建立氧化損傷模型，觀察SPK對細胞形態和活力、三磷酸腺苷(ATP)、NO和NOS活性的影響，評價其對血管內皮細胞的保護作用和作用機制。

1 材料與方法

1.1試藥試劑與儀器 螺旋藻發酵粉(北海市康福保健品有限公司)；人臍靜脈內皮細胞(HUVEC，美國Scien Cell公司)；RPMI1640培養基、胎牛血清(美國GIBCO公司)；Trypsin 1∶250(美國Shellab公司)；ATP、NO、NOS測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。酶標分析儀(Thermo Labsystems公司)；CO2培養箱(美國SHELLAB 公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；超凈工作臺(蘇州安泰公司)；Integral 10 純水儀(美國Millipore 公司)；臺式低溫離心機(湖南長沙平凡有限公司)。

1.2方法

1.2.1藥物的制備 SPK的提取采用水提法：將螺旋藻發酵粉水中浸泡，然后低溫離心后收集上清液，使用硫酸銨進行分級鹽析后收集沉淀，經透析，凍干，凝膠層析后，凍干保存備用，提取得到的SPK比活為2 631 U/mg〔2〕。

1.2.2細胞培養 HUVEC細胞復蘇后，生長于含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養基中，置于37℃、5% CO2的培養箱內常規培養，當生長密度達到90%時開始進行細胞傳代。傳3～4代，細胞生長穩定后開始實驗。

1.2.3實驗分組 將傳3～4代 HUVEC細胞懸液以5×104/孔接種于96孔板，每孔100 μl，貼壁4 h 后，設置正常組(實驗中不加任何物質干擾，完全培養基中正常培養)；模型組(在細胞培養液中加入0.2 mmol/L H2O2進行處理)：陽性對照組〔在細胞培養液中用10 mg/L維生素(Vit)E預處理后，然后加0.2 mmol/L H2O2共培養〕；SPK低、中、高劑量組(在細胞培養液中分別用1、2、3 g/L SPK進行預處理，然后再加0.2 mmol/L H2O2繼續共培養),分別于給藥后24 h收集細胞培養上清液，-20℃冷凍保存待測。

1.2.4SPK對HUVEC細胞活性的影響 HUVEC細胞懸液接種于96 孔培養板中，正常組和模型組加入無血清培養基，陽性對照組和SPK低、中、高劑量組加入所需藥物預孵育12 h；孵育完成后在模型組、陽性對照組和SPK低、中、高劑量組加入濃度為0.2 mmol/L的H2O2進行損傷，時間為4 h，正常組不做藥物處理，繼續培養24 h。實驗結束后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml) ，繼續孵育4 h，去上清加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔，水平搖床振蕩，酶標儀490 nm 波長讀取各孔吸光度(OD)值。

1.2.5形態學觀察 將HUVEC細胞按4×105個接種于12孔板，培養24 h后，按實驗分組干預后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.6細胞培養液中NO含量的測定 取細胞培養上清100 μl，同時設置空白對照和標準測定管，按說明書步驟進行操作。在波長550 nm 0.5 cm光徑，測各管OD值。按說明書計算公式即可得NO含量。

1.2.7細胞培養液中NOS活力的測定 取100 μl收集的上清液，檢測步驟按試劑盒說明書，顯色后酶標儀在530 nm波長下測OD值，根據OD計算NOS活力。

1.2.8ATP含量測定 按1.2.4方法培養后,收集細胞及培養液進行超聲破碎處理獲得細胞破裂懸液，利用肌酸激酶催化ATP和肌酸生成磷酸肌酸的原理，用磷鉬酸比色法對細胞破碎懸液進行檢測。用雙蒸水調零，在636 nm波長，0.5 cm光徑下，測定樣本OD值，按照明書公式即可計算得出ATP含量。

1.3統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、Games-Howell法、t檢驗。

2 結 果

2.1SPK對H2O2損傷HUVEC活性的影響 模型組細胞損傷明顯，細胞活性下降明顯(0.401±0.043)，與正常組相比有顯著性差異(0.867±0.033，P<0.05)；陽性對照組細胞損傷減小(0.547±0.053)，較模型組活性有顯升高(P<0.05)；SPK 低、中、高劑量組細胞活性明顯上升(0.482±0.028、0.531±0.064、0.579±0.074)，與模型組相比，SPK中、高劑量組有顯著差異(P<0.05) ，且呈劑量依賴性加強。

2.2SPK對H2O2損傷HUVEC形態的影響 與正常組比較，模型組細胞間縫隙變大，數量有所減少，細胞變形，漂浮(見圖1模型組箭頭)；而陽性對照組，SPK高、中、低劑量組細胞生長良好，細胞間連接緊密，呈“鋪路石”狀排列(見圖1 SPK中劑量組箭頭)。

圖1 SPK對H2O2刺激下HUVEC形態學的影響(×100)

2.3SPK對細胞培養液中ATP含量的影響 與正常組相比，模型組的ATP含量明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組含量明顯上升(P<0.05)， SPK低、中、高劑量組的ATP含量均明顯上升(P<0.05)，呈劑量效應關系。見表1。

2.4SPK對細胞培養液中NO、NOS含量的影響 與正常組相比較，模型組內皮細胞分泌NO量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比較，陽性對照組和SPK藥物組均能使NO分泌量顯著增加(P<0.05)。與正常組比較模型組NOS顯著下降，SPK高劑量組及陽性對照組NOS顯著高于模型組(P<0.05)，SPK低、中劑量組NOS有上升趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組ATP、NO、NOS含量比較

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

3 討 論

在引起心腦血管疾病發病的危險因素中，血管內皮細胞損傷引起血管壁增生、硬化是一個重要的因素，而NO代謝紊亂、氧化應激被認為是引起血管內皮細胞損傷的重要機制。內皮細胞在氧化應激時出現功能失調，導致血小板黏附、聚集，炎性細胞活化產生炎癥因子，而多種炎癥因子又加重內皮細胞的損傷〔1，2〕。NO是在體內由NOS催化生成的內源性血管舒張因子，它具有抗血小板黏附、抗氧化作用、抗炎性反應、抗平滑肌細胞增殖等作用。NO能清除氧自由基，還能抑制血小板黏附和聚集，阻止內皮細胞表達黏附分子，從而減少炎性細胞與血管壁的黏附，防止血管中膜增生。當血管內皮細胞損傷和功能障礙時，伴隨NO生物活性降低，它含量的變化與心腦血管疾病的發展有密切的關系〔6～9〕。NOS是在體內以L-精氨酸為底物催化生成NO的酶，在正常情況下，NO主要由存在于內皮細胞中的內皮型NOS合成。因此，內皮細胞損傷會影響NOS的活性，繼而影響NO的含量和生物學作用。有實驗證明，當NOS活性增高，引起NO含量增加時，可對抗氧自由基對內皮細胞的損傷〔10〕。

線粒體是一個敏感多變的細胞器，其主要作用是能源物質的氧化和能量轉換，ATP是生物體內能量轉換的基本載體，ATP 水平提示線粒體功能情況，當內皮細胞損傷時會引起線粒體的功能障礙，這可能是血管損傷引起心腦血管疾病中的中間機制〔1，8〕。本實驗通過測定細胞內的ATP水平，了解線粒體的損傷程度及功能情況。本實驗結果證明：內皮細胞氧化損傷時，ATP水平下降， SPK對線粒體有一定的保護作用，可減輕過氧化物對內皮細胞的損傷。

本實驗通過體外培養內皮細胞H2O2造成的內皮細胞氧化性損傷，可使內皮細胞活力下降，而經過SPK預干預后，減弱了H2O2對內皮細胞的氧化損傷作用，使內皮細胞活力明顯增強，ATP水平增加，同時使細胞培養液的NO含量和NOS活性明顯增加，可見SPK的保護功能可能通過增加NO含量來實現預防內皮細胞損傷的發生發展。