外源性睪酮通過誘導自噬致大鼠腎臟損傷

李旭 聶黎虹 秦凱悅 朱亞洲 張航 李佳鑫 趙瑞寧

(寧夏醫科大學 1研究生學院，寧夏 銀川 750004；2總醫院泌尿外科；3基礎醫學院；4 2017級本科生)

腎臟是主要的排泄器官，在維持機體內環境穩態中發揮重要作用。睪酮(TP)是機體中最重要的雄激素，其與腎上腺素受體(AR)結合，在男性的生長、發育、生殖及維持正常生理穩態方面發揮重要作用。AR廣泛分布于腎小球和腎小管，TP與其結合后可影響腎臟的結構和功能〔1〕。由于雄激素特殊的作用，部分人群選擇外源性給予雄激素以達到男性避孕或提高性欲、運動成績的目的〔2，3〕。研究表明，長期大劑量使用TP可引起腎小球濾過率顯著降低，導致腎臟泌尿功能異?！?〕。 但目前對于外源性TP導致腎臟損傷的機制鮮有報道。自噬是真核生物細胞調節生長、死亡、能量代謝的重要機制，其廣泛參與各器官、系統生理及病理生理過程的發生。研究發現，糖尿病腎病、急性腎損傷等腎臟疾病會通過間接誘導細胞自噬而導致腎臟發生損傷〔5〕。新近研究證明，TP可調控細胞自噬水平〔6〕。但關于外源性TP通過調控細胞自噬參與腎臟損傷發生的過程未見報道。本研究旨在探討外源性TP是否通過調節細胞自噬參與腎臟損傷的發生。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 選用SPF級SD雄性大鼠48只，體重(340±10)g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供(許可證號：SCXK(寧)2015-0001)。本研究經寧夏醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑 TP(北京Solarbio公司，中國)；氯喹(CQ，sigma公司，美國)；甘草甜素(Gly，東京化成工業株式會社，日本)；全蛋白提取試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、ECL檢測試劑盒(江蘇凱基生物，中國)；鼠抗β-actin(北京中杉金橋公司，中國)；兔抗HMGB1(Abcam公司，英國)；兔抗LC3B(sigma公司，美國)；兔抗p62、兔抗Beclin1(proteintech公司，美國)；兔抗高遷移率族蛋白B1(HMGB1，Abcam公司，英國)；辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(HRP)標記的二抗；蘇木素-伊紅(HE)、染料(北京中杉金橋公司，中國)。

1.1.3主要儀器 電子天平，顯微鏡(日本 Olympus公司)，高速低溫離心機(美國 Thermo公司)，切片機(德國SLEE公司，型號CUT5062)，全自動酶標儀(美囯Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與模型建立 將SD雄性大鼠(48只)隨機分為6組(每組8只)：control組、TP組、TP+CQ組、TP+Gly組、CQ組、Gly組。TP組大鼠皮下注射TP〔3 mg/(kg·d)〕；TP+CQ組大鼠皮下注射 TP〔3 mg/(kg·d)〕加腹腔注射CQ〔50 mg/(kg·d)〕；TP+Gly組大鼠皮下注射TP〔3 mg/(kg·d)〕加腹腔注射Gly〔10 mg/(kg·d)〕；CQ組大鼠僅腹腔注射CQ〔50 mg/(kg·d)〕；Gly組大鼠僅腹腔注射Gly〔10 mg/(kg·d)〕；control組大鼠腹腔注射生理鹽水〔2.5 ml/(kg·d)〕。各組大鼠的處理時間均為21 d。

1.2.2標本收集與處理 各組大鼠稱重麻醉(10%水合氯醛，0.3 ml/100 g)后，取仰臥位，腹部正中切口，分離并摘取雙側腎臟。一側腎臟稱重后置于4%多聚甲醛中固定；另一側腎臟凍存于-80℃冰箱。大鼠腎臟指數=腎臟濕重(g)/體重(kg)。

1.2.3HE染色觀察腎臟組織形態學改變 取大鼠一側形態結構完整腎臟用冷生理鹽水反復沖洗后，置于4%多聚甲醛中固定，24 h后將其進行修剪后置于包埋盒中脫水過夜；次日進行浸蠟、包埋，冷凝后進行組織切片、烤片；將切片進行脫蠟水化并染色，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；在光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理學變化。

1.2.4組織免疫組化觀察自噬指標表達情況 病理切片二甲苯脫蠟，由高到低的梯度乙醇水化，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復，過氧化氫孵育，山羊血清封閉，各組分別加特異性一抗：抗LC3B-Ⅱ、抗Beclin1、抗P62及抗HMGB1(1∶200稀釋)4℃過夜，山羊抗兔二抗免疫球蛋白(Ig)G 37℃水浴鍋孵育30 min，HRP 37℃水浴鍋孵育30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，由低到高梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。

1.2.5Western印跡法檢測自噬相關蛋白表達水平 取各組大鼠一側腎臟，全蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法定量，然后將樣品按照50 μg/每孔的上樣量加入既定泳道進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳80 min，并通過濕轉轉移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂乳封閉60 min后，將印跡與特異性一抗：抗LC3B-Ⅱ、抗Beclin1、抗P62及抗HMGB1，4℃孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(TBST)洗滌膜三次后，將印跡與相應的二抗孵育60 min，PBST洗膜三次并用增強的化學發光顯色，用凝膠成像儀拍攝。

1.3統計學處理 采用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1各組大鼠體重、腎臟濕重及腎臟指數的比較 各組大鼠體重、腎臟濕重、腎臟指數之間均無明顯變化(P>0.05)，見表1。

2.2各組大鼠腎臟組織形態學分析 control組腎小球大小、形態基本一致；腎小囊間隙均勻；腎小管上皮細胞形態完整且排列整齊，刷狀緣和基底縱紋規整，管腔規則。TP組腎小球毛細血管襻分葉明顯，襻內細胞數增多；腎小囊間隙變窄；腎小管上皮細胞變矮、排列松散且不規整，基底縱紋模糊不清，刷狀緣不規整，大部分官腔閉塞。TP+CQ組和TP+Gly組可見少量且輕微的腎小球毛細血管襻分葉狀改變，腎小囊間隙均勻，與TP組比較，腎小管上皮細胞、刷狀緣及基底縱紋完整度及排列狀況均明顯改善。CQ組和Gly組腎臟病理學情況與control組類似，見圖1。

表1 各組大鼠體重、腎臟濕重和腎臟指數比較

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色結果

2.3各組大鼠腎臟組織蛋白免疫組化染色及表達結果 在control組，LC3B-Ⅱ主要表達于腎小管上皮細胞，Beclin1、P62和HMGB1表達于腎小球、腎小管上皮細胞。LC3B-Ⅱ、Beclin1和P62為胞質、包膜陽性，HMGB1為胞核陽性。見圖2。與control組比較，TP組大鼠腎臟組織LC3B-Ⅱ、Beclin1、HMGB1蛋白表達水平均明顯上調(P<0.05)，P62蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)。與TP組比較，TP+CQ和TP+Gly組腎臟組織蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin1及HMGB1蛋白表達水平均明顯下調(P<0.05)，P62蛋白表達變化無統計學意義；TP+CQ和TP+Gly組比較各蛋白表達變化均無差異(P>0.05)。CQ和Gly組與control組比較，各蛋白表達變化也無統計學差異(P>0.05)，見圖3，表2。

圖2 各組大鼠腎臟組織免疫組化染色結果(×400)

圖3 各組大鼠腎臟組織LC3B-Ⅱ、Beclin1、P62、HMGB1蛋白的表達結果

表2 各組大鼠腎臟組織LC3B-Ⅱ、Beclin1、HMGB1、P62蛋白表達水平的比較

與control組比較: 1)P<0.05，2)P<0.001;與TP組比較:3)P<0.05，4)P<0.001

3 討 論

臨床上雄激素也可用于治療再生障礙性貧血等疾病〔7〕。這些對外源性雄激素的給予可能導致腎臟發生慢性損傷，進而影響其正常生理功能。長期應用TP可明顯降低腎臟的濾過功能〔4〕；TP也可以增加高血壓大鼠腎臟動脈損傷〔8〕。但目前雄激素致腎臟損傷的機制尚未明確。這些現象提示雄激素可能通過調控細胞自噬參與腎臟慢性損傷的病理過程。

本研究提示外源性TP可致大鼠腎臟損傷。同時觀察到，TP組大鼠腎臟組織LC3B-Ⅱ、Beclin1表達水平上調。Beclin1是首個被鑒定介導哺乳動物自噬的蛋白，在自噬體形成過程中是不可或缺的條件〔9〕；LC3B-Ⅱ是自噬啟動的特異性標記蛋白；兩者表達水平增加，提示TP可能通過誘發細胞自噬導致腎臟損傷。隨后，聯合給予自噬抑制劑，腎臟組織Beclin1、LC3B-Ⅱ蛋白表達下調，腎臟病理損傷部分好轉，進一步驗證上調細胞自噬水平是TP致腎臟損傷的機制。實驗還觀察到，TP組HMGB1表達水平升高。HMGB1是重要的自噬調控因子〔10，11〕，不同細胞空間定位的HMGB1均可通過相應機制調控自噬的發生。猜想表達增多的HMGB1可能參與TP致腎臟損傷過程中自噬水平的上調。本研究結果表明在TP致腎臟損傷過程中HMGB1可能通過上調自噬水平參與其中。

綜上，外源性TP可能通過上調細胞自噬水平致大鼠腎臟損傷病理過程的發生，HMGB1可能調節了此過程中自噬水平的改變。但在腎臟損傷的病理過程中，睪酮通過何種方式調控自噬，TP和HMGB1在調控自噬過程中是否具有協同作用等問題均需進一步明確。