microRNA-21在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血清中的表達及意義

徐敏 黃攀 何曉英

(1德陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)外科，四川 德陽 618000；2德陽市人民醫(yī)院；3西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Neuroglioma)是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的50%，發(fā)病率和死亡率均較高〔1〕，手術(shù)切除是目前最主要的治療方式，然而由于腫瘤細胞常呈浸潤性生長，與正常腦組織邊界不明顯，手術(shù)常難以完全清除干凈，因此，積極探索更加有效的治療方式極有必要〔2〕。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)學(xué)發(fā)展模式已經(jīng)從對癥治療轉(zhuǎn)變?yōu)閷σ蛑委煟虼酥挥袑⑸窠?jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制研究得更加透徹才能尋找到更加有效的治療方式〔3〕。microRNA是一類長度17～22個核苷酸序列的非編碼小分子物質(zhì)，可通過與靶基因的mRNA結(jié)合進而影響轉(zhuǎn)錄后翻譯的過程從而發(fā)揮調(diào)控機體生長發(fā)育和疾病發(fā)生的作用〔4〕。microRNA-21是一種與腫瘤關(guān)系密切的小分子RNA〔5〕，研究顯示在多種實體腫瘤的病理組織或外周血中均存在microRNA-21的表達量增高〔6〕。然而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血清中microRNA-21的表達情況及microRNA-21的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未見報道。本研究擬通過RT-PCR技術(shù)及生物信息學(xué)分析的方法進行預(yù)測。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇德陽市第二人民醫(yī)院收治的確診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者53例作為試驗組，年齡31～68歲，平均(39.68±8.72)歲，男28例，女25例；另選取同期健康體檢者50例，年齡(40.24±8.84)歲，男25例，女25例。兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷與治療指南者〔7〕；②臨床資料完整者；③神志清楚能配合研究者；④知情同意；⑤首次確診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤者。排除標(biāo)準(zhǔn) ①非首次確診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤或已經(jīng)治療的神經(jīng)膠質(zhì)瘤者；②嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；③精神異常不能配合者。

1.3標(biāo)本采集 入院時對疑診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的患者采集空腹外周靜脈血，室溫靜置15 min后離心分離收集上層血清并編號，保存于-80℃冰箱用于后期的RT-PCR；若術(shù)后病理證實為非神經(jīng)膠質(zhì)瘤則剔除對應(yīng)編號的血清樣本。

1.4主要試劑與儀器 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、Trizol Reagent、10 mmol/L dNTP MIX均購于美國InvitrogenTM公司；內(nèi)參基因U6及microRNA-21引物序列由武漢金德生物科技有限公司設(shè)計；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo Scientific公司；SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒購于美國TaKaRa公司；PCR儀購于美國ABI公司；熒光定量PCR儀購于Life technologies公司；超凈工作臺購于蘇凈安泰有限公司。microRNA-21的序列為：正義:5′-TGGGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′;反義:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′。內(nèi)參基因U6序列：正義:5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′；反義:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。本研究采用2-△Ct代表microRNA-21的相對表達量，△Ct=(目標(biāo)microRNACt值-U6Ct值)。

1.5生物信息學(xué)分析 采用UCSC數(shù)據(jù)庫對microRNA-21在人類基因組中的位置及保守性進行分析；microRNA-21的靶基因預(yù)測采用TargetScan數(shù)據(jù)庫及CoMeTa數(shù)據(jù)分別進行預(yù)測，取同時出現(xiàn)于二者的靶基因作為microRNA-21的潛在靶基因；采用DAVID基因數(shù)據(jù)庫對microRNA-21靶基因的功能和信號通路進行富集分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血清microRNA-21的表達 試驗組外周血清microRNA-21的相對表達量(2.53±0.95)高于對照組(1.05±0.64)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2microRNA-21在人類基因組中的位置及保守性 在UCSC基因組在線數(shù)據(jù)庫中(http://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redi-rect=manual &source=genome.ucsc.edu)進行如下設(shè)置：Popular Species選擇為Human，Human Assembly選擇為Dec.2013(GRCh38/hg38)，在Position中輸入hsa-miR-21，結(jié)果顯示，microRNA-21在人類基因組中位于染色體17q23.1上的59841266-59841337位點上，長度為72 bp；而保守性分析結(jié)果顯示microRNA-21基因序列在人、小鼠、大象、雞、狗、恒河猴、非洲爪蛙、斑馬魚、七鰓鰻9個物種之間高度保守。見圖1。

圖1 microRNA-21在人類基因組中的位置及保守性分析

2.3microRNA-21可能靶基因預(yù)測 在Targetscan數(shù)據(jù)庫(http://www.target-scan.org/)中將Select a species設(shè)置為Human，在Enter a micro-RNA name中輸入miR-21-5p，結(jié)果顯示共有320個可能靶基因；而在CoMeTa數(shù)據(jù)庫(http://cometa.tigem.it/index.php)首頁中選擇miRNA target predictions(CoMeTa targets link)項，再在Type your Input中輸入hsa-miR-21-5P，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)791個可能靶基因。

2.4通過繪制Venn圖預(yù)測microRNA-21潛在靶基因 通過網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制Targetscan數(shù)據(jù)庫和CoMeTa數(shù)據(jù)庫同時出現(xiàn)的靶基因的Venn圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有146個潛在靶基因。見表1、圖2。

表1 microRNA-21靶基因

續(xù)表1 microRNA-21靶基因

圖2 microRNA-21潛在靶基因Venn圖

2.5microRNA-21靶基因功能富集(GO)分析和KEGG Pathway分析 通過DAVID(https://david-d.ncifcrf.gov/)基因數(shù)據(jù)庫對Venn圖求得的146個交集靶基因進行GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA-21的靶基因主要富集于RNA合成代謝、細胞增殖凋亡、轉(zhuǎn)錄、磷代謝、細胞信號傳導(dǎo)等過程中。而對KEGG Pathway進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA-21靶基因主要富集于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT)信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、軸突導(dǎo)向信號通路、細胞凋亡信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號通路中。其中MAPK是常見的腫瘤信號通路，以JAK-STAT信號通路中的靶基因分布示意圖見圖3～5。

圖3 microRNA-21靶基因KEGG Pathway分析結(jié)果

圖4 microRNA-21靶基因部分GO分析結(jié)果

圖5 microRNA-21靶基因在MAPK信號通路中分布

3 討 論

由于中樞神經(jīng)存在血腦屏障的保護，既往普遍認為對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷或預(yù)測采用循環(huán)血標(biāo)志物意義不大。然而，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，發(fā)現(xiàn)某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可造成血腦屏障結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生破壞，使得腦脊液中的部分物質(zhì)可穿過血腦屏障進入外周循環(huán)血中，因此，這些分子在一定程度上具有預(yù)測或診斷某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用，如腦梗死、腦出血等〔8〕。microRNA是一類小分子物質(zhì)，表達穩(wěn)定，可在外周循環(huán)血中被穩(wěn)定檢測。近年研究發(fā)現(xiàn)microRNA-21具有促進腫瘤細胞增殖、分化等作用，然而關(guān)于microRNA-21在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血清中的表達情況及microRNA-21調(diào)控膠質(zhì)瘤可能的分子網(wǎng)絡(luò)尚不明確〔5〕。本研究利用USUC數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)microRNA-21定位于人染色體12q23.1上，在人、小鼠、大象、雞、狗、恒河猴、非洲爪蛙、斑馬魚、七鰓鰻9個物種之間核苷酸序列高度保守，而RT-PCR結(jié)果顯示神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血清中microRNA-21高表達，可能原因為由于腫瘤的侵襲、生長等可在一定程度上導(dǎo)致血腦屏障的破壞，腫瘤組織中產(chǎn)生的microRNA-21可穿過血腦屏障進入外周循環(huán)血液中，提示microRNA-21參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病。microRNA發(fā)揮生物學(xué)功能是通過與特定靶基因的mRNA堿基互補配對結(jié)合，從而抑制相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯或直接降解相關(guān)mRNA的作用。為進一步探討microRNA-21在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病中可能的分子網(wǎng)絡(luò)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA-21靶基因包括BCL2、SOCS3、MEF2C、PP3CA等146個。于士柱等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)BCL2抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤細胞凋亡進而導(dǎo)致腫瘤細胞過度增殖引起腫瘤體積增大；Lei等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)SOCS3啟動子序列中的甲基化程度的高低與神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分級有明顯關(guān)系；MEF2C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達，能提高膠質(zhì)瘤細胞抵抗缺氧、氧化刺激及增加腫瘤細胞遷移、侵襲的能力。研究顯示性別決定SOX2在正常腦組織中不表達，而在幾乎所有的腦膠質(zhì)瘤中高表達，有研究證實SOX2是癌癥神經(jīng)干細胞維持自我更新的關(guān)鍵因子，其可能是治療惡性膠質(zhì)瘤的潛在靶點〔11～14〕。

采用生物學(xué)信息的方法不僅能快速預(yù)測microRNA-21靶基因，還能對相關(guān)靶基因主要功能及參與的信號通路進行分析。有研究報道MAPK信號通路異常與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)，Antonyak等〔15,16〕研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路中的關(guān)鍵分子P-JNK在腦膠質(zhì)瘤中高表達，李靜等〔17〕研究顯示STAT3信號途徑是治愈腦膠質(zhì)瘤的潛在靶標(biāo)，另有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號通路在腦膠質(zhì)瘤中高度激活且其激活程度與患者預(yù)后關(guān)系密切〔18,19〕。

本研究通過RT-PCR及生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)microRNA-21在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血清中高表達，且可通過調(diào)控多個靶基因參與多條信號通路的調(diào)節(jié)進而參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA表達譜及其調(diào)控機制添加了新的證據(jù)，同時也為今后的研究提供了方向。