吉林漢族人群糖尿病與維生素D受體基因的相關(guān)性

王海英 孫亞東 金濤 武楊 謝立凱 張兵 李柯旻 馬彥 姜艷靜

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春 130000)

糖尿病(DM)發(fā)病機制復(fù)雜，尚未完全闡明，近年來大量研究證實，遺傳易感性對胰島素抵抗、胰島素分泌的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用，通過對2型DM(T2DM)遺傳方式的研究，發(fā)現(xiàn)可能有多個基因參與T2DM的發(fā)生〔1～3〕。作為一系列代謝產(chǎn)物總稱的維生素D，其活性形式是1，25-雙羥維生素D，近年來研究表明，維生素D除經(jīng)典的調(diào)節(jié)鈣磷代謝對骨骼發(fā)育的影響外，還能調(diào)節(jié)體內(nèi)的炎癥狀態(tài)，增強機體的屏障功能，對胰島細(xì)胞具有保護作用〔4〕。而維生素D必須與維生素D受體(VDR)結(jié)合后才能進一步發(fā)揮其生理作用，目前國內(nèi)外不同地區(qū)關(guān)于VDR多態(tài)性與T2DM關(guān)系的觀點尚不一致，本研究旨在探討吉林地區(qū)T2DM患者VDR Bsm1位點基因多態(tài)性的變化研究。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2017年1～6月在吉林省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科門診及住院的T2DM患者150例，按1999年WHO DM標(biāo)準(zhǔn)診斷：空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖(2 hPG)≥11.1 mmol/L，除外腎功能損害及長期服用影響骨代謝藥物者，同期收集吉林省人民醫(yī)院院體檢中心健康體檢者100例，記錄姓名，性別，年齡，體重，身高，血壓。所有研究對象為吉林地區(qū)的漢族人群，無血緣關(guān)系，女性患者排除妊娠，對實驗?zāi)康闹橥狻?/p>

1.2一般資料 完善本研究入組者的姓名、性別、年齡、糖尿病病程、身高、體重、血壓等一般資料。

1.3實驗室指標(biāo) 受試者禁食8～10 h后，晨起抽取空腹肘正中靜脈血，測定FPG、2 hPG、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)，生化指標(biāo)用奧林巴斯AU5400全自動生化分析儀測定，HbA1c使用高效液相色譜法測定。收集每位入選者外周靜脈血4 ml，采用酚-氯仿法提取基因組DNA。通過聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)檢測T2DM患者VDR Bsm1基因多態(tài)性。參照有關(guān)文獻設(shè)計上下游引物，上游引物：5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′，反義鏈：5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′(上海生工合成)。應(yīng)用PCR試劑盒，PCR體系為25 μl，進行PCR。PCR條件：預(yù)變性94℃ 3 min，變性94℃ 30 s，退火62℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，30個循環(huán)，總延伸72℃ 5 min。繼以限制性內(nèi)切酶37℃水解過夜，置4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察，照相記錄結(jié)果。VDR Bsm1位點3種基因型：BB(800 bp)、Bb(800，650，175 bp)、bb(650，175 bp)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用在線軟件檢測是否符合Hardy-weinberg平衡規(guī)律計算基因型和等位基因頻率。采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行t及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般資料比較 兩組性別比、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義，T2DM組FPG、2 hPG、體重指數(shù)(BMI)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 兩組一般情況的比較

與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

2.2VDR Bsm1位點多態(tài)性結(jié)果判定 瓊脂糖凝膠上電泳，酶切后PCR產(chǎn)物結(jié)果，顯示800 bp一條帶，用BB表示；顯示800 bp、150 bp、650 bp三條帶，用Bb表示；顯示650 bp和150 bp兩條帶，用bb表示，見圖1。

1：Marker;2:BB基因型；3：Bb基因型；4～6：bb基因型；7：正常對照組

2.3兩組VDR Bsm1位點基因型及等位基因分布比較 兩組基因型分布均符合Hardy-weinberg平衡。T2DM組中BB基因型出現(xiàn)頻數(shù)為2，所以將BB、Bb基因型合并分析。T2DM組BB+Bb基因型明顯高于正常對照組(37.33%vs 12.00%，P<0.05)，B等位基因頻率明顯高于正常對照組(19.34%vs 7.00%，P<0.05)，基因型bb明顯低于正常對照組(62.67%vs 88.00%，P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組VDR Bsm1各基因型和等位基因分布比較〔n(%)〕

2.4T2DM組Bsm1各基因型臨床特征的比較 與總體T2DM組相比較，BB+Bb組及bb組各基因型中，糖尿病家族史、高血壓病史、發(fā)病年齡、BMI、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C等臨床特征均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 T2DM組VDR Bsm1基因組型臨床特征的比較

3 討 論

目前T2DM發(fā)病機制復(fù)雜，近年來大量研究證實，遺傳易感性對胰島素抵抗、胰島素分泌起著重要作用〔5，6〕，T2DM是一種多基因遺傳性疾病，尋找T2DM的易感基因是慢病防治工作的任務(wù)需要。

VDR基因是甾體類受體超家族中的一員，位于細(xì)胞核上，表達(dá)于皮膚、骨骼、小腸、腎、脂肪組織以及胰腺等，現(xiàn)有研究提示這些組織可能是維生素D的靶器官，VDR在胰腺的表達(dá)可能會影響胰島功能，在骨骼肌和脂肪組織的表達(dá)可能會影響外周組織胰島素的敏感性〔7〕。VDR基因由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)25個以上的限制性內(nèi)酶酶切位點，最常見的是Fok1、Bsm1、Taq1和Apa1。

維生素D在肝臟經(jīng)25-羥化酶作用后生成25-羥基維生素D，血液循環(huán)中25-羥基維生素D半衰期相對穩(wěn)定，因此成為評估體內(nèi)維生素D水平的主要指標(biāo)。目前很多關(guān)于25-羥基維生素D對機體糖代謝異常調(diào)節(jié)機制的研究表明，T2DM患者伴隨25-羥維生素D水平的下降，胰島β細(xì)胞早期相胰島素分泌和總體胰島素分泌功能是進一步下降〔8，9〕。國外學(xué)者的體內(nèi)外研究表明，在生理條件下糖代謝調(diào)節(jié)過程中，維生素D是葡萄糖刺激胰島素分泌及維持正常糖耐量的必需物質(zhì)之一，維生素D缺乏會減少葡萄糖負(fù)荷后的胰島素釋放，可增加糖調(diào)節(jié)受損，從而導(dǎo)致T2DM的患病風(fēng)險增加〔10，11〕。研究表明，維生素D缺乏可通過細(xì)胞間鈣離子的變化影響胰島素的分泌和敏感性，這與糖原合成和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)-4的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)有關(guān)〔12〕。維生素D缺乏還會增加白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，這將導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生〔13〕。

1，25-二羥維生素D在機體中必須通過與VDR結(jié)合才能發(fā)揮其生理效應(yīng)。T2DM患者維生素D缺乏與組織中VDR缺乏明顯相關(guān)，VDR基因的改變導(dǎo)致T2DM發(fā)生的機制總結(jié)如下：血漿中鈣離子代謝的改變及其對胰島素合成和分泌的調(diào)節(jié)，VDR基因?qū)χ窘M織功能的調(diào)節(jié)，VDR基因?qū)σ葝u素分泌的調(diào)節(jié)和對細(xì)胞因子表達(dá)的改變〔14〕。本研究結(jié)果表明VDR基因Bsm1位點多態(tài)性與中國吉林地區(qū)漢族人群T2DM密切相關(guān)，可能是該地區(qū)人群T2DM的一個易感基因，為從基因水平認(rèn)識DM的發(fā)病機制提供了一個新的思路。國外學(xué)者對VDR基因?qū)ρ降难芯堪l(fā)現(xiàn)，維生素D受體與TC、TG、LDL-C水平呈負(fù)相關(guān)，與HDL-C 水平呈正相關(guān)性〔6〕。本研究結(jié)果考慮與種族差異有關(guān)，還有本研究樣本量的影響。