間充質干細胞治療骨關節炎的研究進展

張旭　豐哲　李富濤　陳禺　崔真偉

【摘 要】 骨關節炎是以關節疼痛、僵直畸形及功能障礙為主要臨床表現的疾病，關節軟骨退變及損傷是其最根本的病變。目前，骨關節炎臨床治療效果并不理想，手術治療具有高風險、高費用及術后并發癥等一系列問題，大部分保守治療只能緩解癥狀。隨著醫療水平不斷提高，通過干細胞及細胞因子修復受損軟骨是目前治療骨關節炎的一種新思路，故對近年來間充質干細胞治療骨關節炎的研究進行綜述。

【關鍵詞】 骨關節炎;軟骨細胞;軟骨修復;間充質干細胞;研究進展;綜述

骨關節炎（osteoarthritis，OA）作為一種最常見的骨關節疾病，已成為醫學領域面臨的一大難題，現有的臨床治療效果并不理想，只能起到緩解病情的作用。隨著骨組織工程和軟骨再生醫學領域的迅速發展，利用干細胞及細胞因子已逐漸成為治療OA的一種新方法。其中，間充質干細胞（MSC）以其來源廣泛、獲取創傷小、繁殖能力強、具有良好的軟骨分化潛能等優勢，已成為治療OA的重點研究細胞，有望在OA的治療中發揮重要作用。本文主要介紹基于MSC的軟骨修復作用治療OA的研究現狀及應用前景。

1 OA與軟骨修復

OA是以軟骨退行性變、消失，以及關節邊緣韌帶附著處和軟骨下骨反應性增生形成骨贅，并由此引起關節疼痛、僵直畸形和功能障礙為主要病理改變的慢性骨關節疾病，又稱退行性關節炎、增生性關節炎、肥大性關節炎等。目前，OA的發病機制尚未完全闡明，相關研究顯示，老齡化、體質量指數（BMI指數）超常、持續勞損、關節創傷、畸形、遺傳因素、細胞因子異常、關節內微環境異常、生物力學改變等因素都與OA的發病密切相關[1]。關節軟骨退變及損傷是其最根本的病變。關節軟骨是構成關節表面的主要部分，具有承受重力、緩沖壓力及潤滑關節等作用。軟骨被破壞后，兩骨端直接接觸，反復摩擦產生炎癥，軟骨下骨及滑膜也隨之改變[2]。由關節磨損或創傷引起的關節軟骨缺損，根據是否延伸至軟骨下骨可分為部分或全部厚度損傷[3]，這些缺損會導致軟骨闡明退化，最終形成OA，導致患者關節劇烈疼痛、畸形、活動障礙，甚至殘疾，生存質量嚴重下降。隨著社會年齡組成結構改變[4]，OA的發病率逐漸上升，全世界有超過2.5億人受到影響，藥物及住院治療費用的增加，也給整個社會帶來了沉重的經濟負擔[5]，本病已成為醫療系統所面臨的嚴峻問題，和心腦血管疾病、癌癥并稱為威脅人類健康的“三大殺手”。

研究發現，OA的演變與軟骨細胞對生長因子的不良反應、關節軟骨的生物力學特性改變、線粒體功能障礙、氧化應激和炎癥等因素有關[6]。軟骨主要是由細胞外基質（ECM）中的軟骨細胞分化形成，隨著人體衰老及關節磨損，軟骨細胞數量的減少會影響ECM蛋白的產生。由于軟骨的無血管性質，自我修復能力有限[7]，當前的軟骨修復方法包括保守療法和手術療法。保守療法包括關節內注射皮質類固醇、透明質酸以及口服硫酸軟骨素等[8-9]，但是這些治療大部分只能緩解疼痛，并且缺乏明確有效治療OA的證據[10]。手術療法包括關節鏡手術（微骨折和微鉆孔）、骨軟骨移植和自體軟骨細胞植入（ACI/ACIC）[11]等，這些技術旨在通過促進血管浸潤，纖維蛋白凝塊形成和干細胞募集促進軟骨再生，在OA治療中具有一定軟骨修復作用[12]。但是，同時可能形成缺乏耐用性的機械性軟骨[13]，移植物（如軟骨膜和骨膜）鈣化或退化，移植物與受區軟骨附著性差和移植物丟失率高，供區繼發組織缺損[14]，膨脹的軟骨細胞可能發生去分化從而產生低質量的軟骨[15]，在晚期造成更嚴重的OA。隨著細胞再生醫學及軟骨修復在OA治療中的優勢效果和問題的出現，基于MSC的軟骨修復或許可以為OA提供一條新的治療研究思路。

2 MSC治療OA的應用現狀

2.1 MSC的來源及特點 MSC是中胚層衍生的非造血細胞，可以輕松地從骨髓、脂肪組織、臍帶血等中分離出來，并在體外擴增以獲得大量的細胞用于軟骨修復治療[16]，通過密度梯度離心法和酶消化、熒光或磁性激活的細胞分選，以及其他基于抗體的高度自動化選擇性系統獲得純凈MSC細胞并去除非貼壁細胞[17]（主要是造血干細胞）。主流MSC細胞擴增系統包括靜態平面系統[18]與動態系統，靜態平面系統中的T型燒瓶、多層燒瓶培養方式轉移方便，細胞在2D平面培養，但其細胞擴增性有限，而且采集困難，培養效率低;動態系統中的介質再循環生物反應器[19]（多板生物反應器、固定床生物反應器、中空纖維生物反應器）與懸浮生物反應器[20]（攪拌生物反應器）通常用于細胞的大規模擴增，大部分是通過模擬人體獨特的關節細胞微環境3D多層培養，可以監視和控制培養參數，更精確及時地干預，產生更高質量的MSC。MSC可分為骨髓MSC（BMSCs）、脂肪干細胞（ADMSCs）、臍帶MSC（UC-MSCs）等，其中BMSCs可以通過細胞間的相互作用及產生細胞因子抑制T細胞的增殖及免疫反應[21]，而且易于分離、培養、擴增和純化，多次傳代擴增后仍具有干細胞特性，不存在免疫排斥的特性，常用于OA軟骨修復研究。不論細胞來源如何，MSC都可以在誘導劑[包括轉化生長因子β（TGF-β）和骨形態發生蛋白（BMP），胰島素樣生長因子（IGF），胰島素轉鐵蛋白-硒和肝細胞生長因子]刺激下發生軟骨分化[22]。MSC以其來源廣泛、獲取創傷小、增殖能力強、具有良好的軟骨分化潛能等諸多優勢成為目前最有應用前景的軟骨修復種子細胞，并得到廣泛研究應用[23]。

2.2 MSC的軟骨修復機制 隨著軟骨修復與細胞再生醫學的研究，了解正常軟骨生成的調控非常重要，因為基于MSC的軟骨修復技術至少部分涉及了人體軟骨的主要發育步驟。ECM主要是由膠原蛋白和蛋白聚糖組成，人體軟骨根據ECM的成分差異分為3種類型：彈性軟骨、纖維軟骨和透明軟骨。其中纖維軟骨被認為是致密結締組織和透明軟骨之間的過渡組織[24]，如半月板和椎間盤，這是唯一包含Ⅰ型膠原的軟骨;透明軟骨也叫關節軟骨，存在于滑膜關節表面，主要由Ⅱ型膠原蛋白和硫酸化蛋白聚糖（aggrecan）組成。在軟骨形成的早期，軟骨祖細胞會產生富含透明質酸、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原蛋白的ECM[25]，通過N-鈣黏蛋白的細胞間相互作用，間隙連接和細胞黏附分子的出現介導了其聚集至軟骨前凝結[26]。通過這些細胞相互作用以及ECM中的纖連蛋白、腱糖蛋白和血小板反應蛋白觸發細胞內信號傳導聯級反應，使分化的軟骨祖細胞能夠獲得軟骨細胞的典型球形形態，并啟動軟骨特異性ECM分子的合成。在MSC培養中通過許多細胞外信號分子、生長因子和信號通路（如FGF、TGF-β、BMP及N-鈣黏蛋白、MAPK、Notch通路）的相互作用促進細胞黏附，避免肥大性分化，誘導軟骨形成[27]。在OA中，軟骨細胞的破壞會釋放炎性因子抑制膠原蛋白和蛋白聚糖的合成[28]。MSC能通過募集到軟骨損傷部位發揮抗炎作用，影響炎癥因子表達，延緩軟骨進一步破壞[29]。研究發現，MSC具有旁分泌作用[30]，從植入的MSC釋放的微囊泡中含有的生長因子、細胞因子、生物活性物質可以促進軟骨細胞增殖及膠原蛋白合成，使OA患者疼痛緩解和功能改善。目前，MSC在軟骨形成的分子作用機制仍不明確，為了避免產生纖維軟骨、肥大性軟骨及軟骨骨化，仍需要進一步深入MSC的軟骨定向分化表達基礎研究。

2.3 MSC在治療OA中的應用 目前，使用MSC進行軟骨細胞治療OA已有相當多的實驗及臨床研究，主要集中在將各種擴增系統收獲的MSC與粘合劑（基于密封劑）混合，或接種在生物相容性支架（基于支架）上將其遞送至軟骨損傷部位兩種方式[31]。通過一些天然生物材料（包括膠原蛋白、明膠、硫酸軟骨素、透明質酸等）或合成生物材料[例如聚乙二醇（PEG）、聚氨酯（PU）等]與MSC混合制成密封劑，由于其優異的生物相容性[32]，強黏附性、可生物降解和低免疫反應等特性被廣泛應用。WAKITANI等[33]在2002年報告了第1個BM-MSC移植試驗，使用膠原蛋白凝膠作為密封劑修復膝OA中的人類軟骨缺損，通過BMSCs募集到軟骨損傷部位促進膠原蛋白合成，結果發現，移植42周后在缺損處部分可見透明軟骨樣組織覆蓋。此后，還有其他報道表明，將基于密封劑凝膠的MSC懸浮液與各種天然生物材料結合使用不同的ECM都具有良好的軟骨修復效果[34]。YONGBEOM等[35]通過同種異體UC-MSCs

和透明質酸水凝膠的復合體在OA患者中的軟骨再生研究，雖然是同種異體細胞，但其易于從臍帶血庫中獲得，屬于非侵入性采集，細胞免疫性低，能抑制T細胞的增殖并分化成軟骨組織，影響炎癥因子表達，經過7年的隨訪，未觀察到明顯的不良事件，在持續性軟骨再生方面似乎是安全有效的。然而，不同批次之間的天然密封膠可能會發生變性，影響修復能力。另一方面，通過支架技術修復軟骨也在逐步研究。UEMATSU等[36]通過接種有培養的MSC的PLGA支架修復兔膝蓋大缺陷的軟骨，成功誘導了軟骨形成，這種支架可以增強MSC的細胞黏附、增殖和隨后的成軟骨分化，具有良好的生物相容性和可降解性，營養物質可以通過支架中適當的孔徑擴散，能夠承受體內負載環境并保護嵌入的MSC免受機械應力破壞。在另一項大鼠軟骨缺損模型研究中，MSC接種的PLGA/NHA支架與PLGA支架相比，MSC的存活力和增殖明顯更好，可以形成發育更加成熟良好的透明軟骨組織[37]。另一種MSC形式的支架是使用可植入和降解的生物材料，將其直接植入缺損部位。與僅植入MSC相比，在PCL MC上將MSC植入軟骨缺損兔模型中細胞微載體可以模擬體內三維細胞培養環境，有利于細胞遷移和增殖，微載體表面的BMP-7可以增強MSC骨修復和抗菌能力，顯示出更好的軟骨形成分化，更節省時間[38]。然而，基于支架的技術尚不成熟，尚未在臨床試驗中應用，目前很少有使用基于支架的方法進行軟骨的臨床試驗（Ⅰ/Ⅱ期），并且尚無Ⅱ/Ⅲ期試驗的報道。不過支架的MSC構建體具有優勢，尤其是在治療更嚴重的軟骨損傷方面（例如全厚度缺損），因為它們能夠承受體內OA局部炎癥性微環境并保護嵌入的細胞免受任何機械應力的作用[39]。隨著新改進支架的開發，例如PCL微載體和改良的PLGA支架顯示出許多可能的優點，將來可能會有進一步的臨床研究。許多臨床前和臨床研究已經證明了使用MSC（基于密封劑或基于支架）進行治療的可行性，但是，仍然有一些挑戰需要解決。由于細胞生長和軟骨分化效率的差異，MSC分離過程中會產生異常的細胞群，這就需要有能鑒定和可能分離有效細胞的生物學標記獲得更純凈的MSC細胞群[40]。雖然MSC在OA治療方面還存在一定限制和問題，但其軟骨修復的巨大潛力對未來OA治療的方向仍具有研究意義。

3 展 望

目前，OA的治療主要以緩解臨床癥狀、改善關節活動功能、提高患者生存質量為主，治療方法主要有控制體重、健康宣教、理療、藥物治療和手術治療。各種療法在一定程度上有助于緩解疼痛，但不能改變關節軟骨退變的進程，且不能徹底治愈OA，疾病發展到晚期時，關節置換術可能成為唯一的、不可避免的選擇。但是，目前可用的假體壽命有限，無法滿足年輕患者的需求。隨著細胞再生及軟骨修復的研究，MSC具有來源廣泛、增殖能力強、良好的軟骨分化潛能等諸多優勢，其抗炎、旁分泌作用能明顯促進軟骨修復，延緩OA的發展。雖然目前基于MSC細胞進行軟骨修復的治療在臨床中具有一定限制，但其軟骨再生潛力在治療OA中仍具有較大研究意義。進一步研究其細胞軟骨分化機制和臨床作用將為治療OA提供指導，細胞軟骨修復或許是未來治療OA的方向和希望。

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收稿日期：2020-04-01;修回日期：2020-05-19