組織蛋白酶Cathepsin B 對喉癌細胞侵襲轉移的影響

陳立偉，翟性友，黃邦清，劉宸箐，張永俠，趙建東，劉明波

1解放軍總醫院海南醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，海南三亞 572013；2 解放軍總醫院第一醫學中心 耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100853

喉癌是最常見的呼吸道腫瘤之一，過去幾十年中，喉癌的治療取得了較大的進展，雖然手術治療依然是喉癌治療的主要手段，但放療及全身綜合治療也漸成為喉癌治療的方式之一[1]。因此，尋找調節喉癌侵襲、轉移的關鍵調節因子，成為喉癌基礎研究的重點之一。腫瘤的侵襲轉移離不開侵襲前緣細胞外基質廣泛的蛋白水解作用。基底膜的破壞和細胞外基質的降解被認為是腫瘤得以發生轉移的關鍵環節，這個過程離不開許多蛋白水解酶的分泌和表達，這些蛋白降解酶使基底膜產生局部缺損，為腫瘤細胞的移動形成通道[2]。根據酶催化的底物和pH 不同，蛋白降解酶可分為絲氨酸蛋白酶、基質金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶四大類。各種蛋白降解酶具有與腫瘤相關的多種生物學功能，在腫瘤的啟動、侵襲、血管生成及轉移等過程中發揮一定作用。組織蛋白酶(Cathepsin)是存在于溶酶體的細胞內半胱氨酸蛋白酶，在蛋白的降解和加工中發揮重要作用，與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關[3]。正常情況，組織蛋白酶與其內源性抑制劑含量保持平衡，在腫瘤中，組織蛋白酶與其抑制劑平衡被破壞，導致組織蛋白酶表達量或活性增高，促進腫瘤的發生、發展[4-7]。我們前期研究中發現無論在喉癌組織還是患者血清中，組織蛋白酶Cathepsin B 含量均顯著高于正常對照組，提示Cathepsin B 在喉癌發生、發展中可能起到關鍵作用[8-9]。本研究通過體外試驗，應用Cathepsin B 特異性抑制劑CA-074Me 處理喉癌Hep-2 喉癌細胞后，分析喉癌細胞活性的變化，從而推測Cathepsin B 在喉癌發生發展中的作用。

材料和方法

1 細胞培養及處理 喉癌Hep-2 細胞購自北京協和醫學院基礎醫學研究所，在含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM 培養基中于37℃、5% CO2培養箱中培養。待60 mm 培養皿中Hep-2 細胞融合度達70%時，應用環氧酶琥珀酰肽甲基酯CA-074Me 按10μmol/L 的濃度處理細胞12 h、24 h(實驗組)。對照組為正常培養Hep-2 細胞，不加CA-074Me 處理。

2 Western blot 蛋白檢測實驗 CA-074Me 處理細胞12 h、24 h 后，分別收集實驗組和對照組腫瘤細胞，提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法定量后按每孔80 mg 上樣電泳，12%分離膠，120 V 電泳2.5 h后，在100 V、1.5 h 條件下將蛋白轉移到NC 膜上，膜用10%脫脂奶粉TBST 溶液4℃封閉過夜，Cathepsin B 兔多克隆抗體(Abcam Hong Kong Ltd，1 ∶1 ∶250 稀釋)37℃孵育1 h，TBST 洗3 遍后用HRP 標記的二抗1 ∶4 000 稀釋與膜孵育40 min，再洗3 遍后，用超敏發光液(ECL)發光檢測蛋白表達水平的變化。

3 Transwell 細胞侵襲和遷移實驗 細胞侵襲實驗：用Matrigel(Becton Dickinson and Company，1 mg/ml)膠包被Transwell 小室(Corning Incorporation 孔徑8mm)，放于24 孔板中，將溶解于100 ml DMEM培養基中約1×105個細胞培養于小室上層，小室下層加入1 ml 含10%胎牛血清的DMEM 培養基。培養48 h 后，取出Transwell 小室，用蘸有PBS 的棉簽擦去小室上層的細胞，取下Transwell膜，75%甲醇固定細胞30 min 后，0.1%結晶紫染色15 min，清水洗凈，放在載破片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下隨機選取5 個視野照相、計數穿過濾膜細胞。細胞遷移實驗步驟同侵襲實驗，區別是Transwell小室不鋪Matrigel膠，接種細胞數減半，培養12 h 后染色計數。實驗組及對照組均每組接種5 孔。

4 MTT 細胞增殖實驗 實驗組在接種前應用10μmol/L 的CA074Me 處理Hep-2 細胞24 h。收集細胞，然后按103/孔密度接種細胞于96 孔板中，在含10%胎牛血清的DMEM 培養基中培養，分別于第1、2、3、4、5、6、7 天加入20 μl MTT(5 mg/ml Sigma-Aldrich Corp)，繼續培養4 h 后，加入150 ml DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，490 nm 酶聯免疫檢測儀檢測各孔光吸收值。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸，繪制細胞增殖曲線。對照組為正常培養Hep-2 細胞。

5 統計學分析 采用Stata 軟件進行統計分析。觀測數據均為計量資料，以±s 表示，兩組間比較用t 檢驗，三組間比較用單因素方差分析+多重比較LSD-t 檢驗，依時間變化數據組間比較采用重復測量方差分析。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 CA-074Me 抑 制Hep-2 細 胞Cathepsin B 蛋 白表達 應用CA-074Me 按10 mmol/L 的濃度處理Hep-2 細胞12 h 后，Western blot 試驗檢測Hep-2細胞Cathepsin B 蛋白表達水平出現明顯降低，處理24 h 后，Cathepsin B 蛋白表達的降低更加顯著，達到抑制其表達、進行功能研究的目的。見圖1。

2 CA-074Me 抑制Hep-2 細胞侵襲、遷移能力 CA-074Me 處理24 h Hep-2 細胞后，Cathepsin B 蛋白表達被抑制，此時，Transwell 試驗顯示，Hep-2細胞降解Matrigel 膠穿過Transwell 小室的侵襲能力顯著低于對照組：34.8±4.6/field vs 83.6±4.5/field (P ＜0.01)。Hep-2 細胞穿過Transwell 小室的遷移能力也顯著降低：33.4±3.8/field vs 82.0±4.2/field (P ＜0.01)。見圖2。

3 CA-074Me 抑制Hep-2 細胞增殖能力 將Hep-2 細胞和CA-074Me 處理24 h 后的Hep-2 細胞連續培養7 d，經重復測量方差分析發現CA-074Me 處理后的Hep-2 細胞增殖能力從第3 天開始顯著低于對照組，說明抑制了Cathepsin B 蛋白表達后，喉癌細胞的增殖能力被顯著抑制。見圖3。

圖 1 Western blot檢測Hep-2細胞中Cathepsin B水平。 Hep-2:正常培養Hep-2細胞; Hep-2-CA-074Me(12 h): CA-074Me處理Hep-2細胞12 h；Hep-2-CA-074Me(24 h): CA-074Me處理Hep-2細胞24 h； aP ＜0.01Fig. 1 Western blot was used to detect the level of cathepsinB in Hep-2 cells. Hep-2: Hep-2 cells were cultured normally; Hep-2-CA-074Me (12 h): CA-074Me Hep-2 cells were treated with CA-074Me for 12 hours; CA-074Me (24 h): Hep-2 cells were treated with Hep-2-CA-074Me for 24 hours. aP ＜0.01

討 論

圖 3 MTT試驗Hep-2細胞增殖能力檢測(Hep-2:正常培養Hep-2細胞; Hep-2-CA-074Me：CA-074Me處理Hep-2細胞； aP ＜0.01)Fig. 3 MTT assay was used to detect the proliferation of Hep-2 cells (Hep-2: Hep-2 cells cultured normally; Hep-2-CA-074Me: Hep-2 cells were treated with CA-074Me； aP ＜0.01)

頭頸鱗癌是全球范圍內第六大常見腫瘤[10]。早期發現治療效果較好，晚期患者治療效果欠佳。據報道，T1、T2 期的喉癌治愈率達80% ～ 90%，而臨床Ⅳ期喉癌患者，5 年生存率僅約40%，2/3患者確診時已為晚期[11-12]。95%的原發性喉癌為鱗狀細胞癌。近年來無論國內外報道，喉癌的治療效果均沒有明顯提高，因此尋找調控喉癌發生發展的關鍵因子，有利于探索喉癌的分子靶向治療。

組織蛋白酶Cathepsin B 是存在于溶酶體內的一種蛋白酶，在溶酶體的酸性環境下進行自催化活化，形成活性組織蛋白酶。在腫瘤發生發展中，Cathepsin B 與細胞增殖、血管生成、炎癥、侵襲、轉移及細胞凋亡相關[13]。文獻報道其高表達與乳腺癌、黑色素瘤、結直腸癌等多種腫瘤密切相關[5,14-17]。Cathepsin B 在腫瘤組織中活性增加，既是由于Cathepsin B 內在表達的增加，又與內源性低分子量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑調控下降相關。組織蛋白酶的抑制物大致包括Stefin A(Cystatin A)、Cystatin C 和Kininogens。抑制Cathepsin B 后能降低其對膠原蛋白的降解能力，抑制腫瘤細胞轉移能力[18-19]。既然Cathepsin B 在腫瘤的侵襲、轉移中起到重要作用，那么對于晚期腫瘤，Cathepsin B 的特異性抑制劑對于腫瘤意義更大。研究發現，在具有自發性骨轉移乳腺癌的免疫活性模型中，腹膜內施用高選擇性Cathepsin B 抑制劑CA-074，而不是廣譜半胱氨酸組織蛋白酶抑制劑JPMOEt，減少了腫瘤的轉移[20]。本研究中，我們應用Cathepsin B 選擇性抑制劑CA-074Me 體外處理喉癌Hep-2 細胞24 h，Cathepsin B 的表達量顯著下降后，Hep-2 細胞體外侵襲、遷移能力明顯下降。體外增殖試驗顯示，Cathepsin B 低表達后腫瘤細胞體外增殖能力也顯著降低。提示Cathepsin B 的過表達促進喉癌細胞的增殖，并且增強了腫瘤細胞的侵襲、轉移能力。更加明確了Cathepsin B 基因在喉癌侵襲和轉移中起到的重要作用。綜上，Cathepsin B 在喉癌侵襲轉移中起到重要作用，通過抑制其表達，有望降低喉癌患者腫瘤的侵襲和轉移。Cathepsin B 或可成為喉癌治療的新靶標。

Fig. 2 Transwell test was used to detect the invasive ability (A, B, C) and the migration ability (D, E, F) of Hep-2 cells (Hep-2: Hep-2 cells were cultured normally; Hep-2-CA-074Me：Hep-2 cells were treted with CA-074Me; aP ＜0.01)