迪慶藏豬Nramp1基因第二內含子和第二外顯子多態性位點遺傳分析

相德才，張 斌，劉邵娜，楊仁燦，趙彥光

（1.云南省畜牧獸醫科學院，云南 昆明 650224；2.云南省種豬性能測定站，云南 昆明 650224；3.云南省種豬質量檢驗測試中心，云南 昆明 650224）

天然抗性相關巨噬蛋白基因（Natural resistance associated macrophage protein,Nramp1）由于其相對保守序列結構，對不同類型病原菌具有多效性，是研究免疫疾病的候選基因之一。1998年，Sun將豬Nramp1定位于第15號染色體的q23～26區域[1]。包含15個外顯子和14個內含子，外顯子分別編碼8～12個轉膜區域，全長序列大約15 kb，cDNA序列為1 617 bp，編碼539個氨基酸[2]。Nramp1基因主要在脾臟、大腦和肺臟等網狀內皮細胞器官的巨噬細胞中表達，用于抵抗外來病原微生物[3]。晏學明[4]在地方豬種的Nramp1基因的外顯子1至外顯子3之間發現了3個等位基因和4種基因型，并在藏豬的4個群體間發現了基因位點的遺傳分化差異。

迪慶藏豬主要生活在云南省迪慶藏族自治州境內，主要以放牧方式進行飼養，對不良的生活環境具有良好的抵抗力且具有良好的肉品質，迪慶藏豬的這些特點是現有規?；B殖中引進豬種所不具備的。本研究以迪慶藏豬為研究對象，利用測序技術對Nramp1基因內含子2和外顯子2進行SNP篩選，并對SNP位點進行遺傳分析，為迪慶藏豬免疫疾病研究和抗病分子育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究隨機挑選57頭10月齡迪慶藏豬為試驗材料，于2018年10月在迪慶藏族自治州迪慶藏豬保種場，采集其耳組織置于裝有75%酒精的離心管中，-20℃保存。利用組織基因組DNA提取試劑盒提取耳組織基因組DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA濃度。

1.2 引物設計

根據GenBank提供的豬Nramp1基因序列（NC_010457.5）， 用Primer Premier 5.0與 Oligo 6.0軟件設計引物序列1對，引物序列為F：5'-TCATGA CAGGTGAGTAGCCC-3'，R：5'-CTTGGCCAGAGAGA TCCCAT-3'，擴增片段長度為735 bp，送英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.3 PCR擴增和測序

PCR擴增體系總體積為25 μL，包含Mix 12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，基因組 DNA模板（約 50 ng）2 μL，8.5 μL ddH2O。 PCR 擴增反應條件為94℃預變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，40個循環；72 ℃延伸 7 min；4℃保存。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，而后送至中美泰和生物技術（北京）有限公司進行測序。

1.4 統計方法

采用genestar軟件對測序數據進行分析比對，并用Excel對數據進行計算。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果和測序結果

PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統檢測，結果見圖1，由圖1可見，擴增產物片段的特異性較好，大小約為735 bp，表明PCR擴增獲得了想要的目的片段。

經過對測序結果的分析，由圖2可知迪慶藏豬在Nramp1基因內含子2上存在6個SNP位點，分別是G841A、G892T、G1069A、G1085A、G1189A和T1347C；在外顯子2上存在1個SNP，是A1377G。

2.2 基因頻率和基因型頻率分析和遺傳特性分析

對各SNPs進行了基因頻率、基因型頻率、多態信息含量、純合度、雜合度計算（表1）。結果顯示，各位點在迪慶藏豬豬群中均處于Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。群體遺傳分析顯示，本研究發現的SNPs多態信息含量處于低度多態和中度多態，G892T和 A1377G位點最高（0.357 5），G1189A位點最低（0.090 5）；雜合度均小于0.5，G892T和A1377G位點最高（0.466），G1189A位點最低（0.095）。

由圖3可知，其中snp2與snp5、snp6和snp7，snp4與snp5，snp5與snp6和snp7之間的D′值接近1，說明這些位點間發生重組的可能性很??；snp1與snp6之間D′值接近0，說明兩位點間連鎖平衡的可能性很?。欢鳧′值接近中間值的則無法比較兩位點連鎖平衡的差別。

表1 不同SNP位點基因頻率、基因型頻率、多態信息含量、純合度、雜合度

單倍型分析結果如圖4，常見單倍型有6種，累計頻率為77.73%，其中單倍型1的頻率為39.98%，單倍型2的頻率為14.93%，單倍型3的頻率為7.89%。

3 討論

趙生國等[5]在Nramp1基因在外顯子2上檢測到2個等位基因（A和T）和3種基因型（AA、AT和TT）。本研究在迪慶藏豬Nramp1基因第2內含子和第2外顯子一共發現7個SNPs，雖然本研究發現的非編碼區突變位點并參與編碼功能，但非編碼區的突變對編碼功能也有一定的作用，所以本研究發現的非編碼區突變位點是否會影響迪慶藏豬Nramp1基因的表達和功能還需進行下一步的深入研究。

Nramp1基因作為控制動物抗病力性狀的主效基因之一，在網狀內皮細胞器官中的表達已被證實與沙門氏菌以及多種胞內寄生病原菌的抵抗作用有關[6]。通過本研究了解了迪慶藏豬Nramp1基因的變異情況及群體遺傳特征，為下一步開展基因的遺傳育種奠定了理論基礎。經Hardy-Weinberg平衡檢驗，各SNPs均處于平衡，說明人工選擇壓較小，有利于發展下一步的抗病育種工作。

多態信息含量（PIC）和雜合度（He）是衡量等位基因多態性，基因突變變異程度高低的指標，也是群體內遺傳變異大小的評定指標，數值越高，遺傳變異越大。本研究發現所有的SNPs的多態信息含量和雜合度均小于0.5，說明群體內基因型遺傳變異較小，選擇潛力也比較小，為下一步研究Nramp1基因SNPs的基因型對沙門氏菌及多種胞內病原微生物的抵抗作用提供重要依據。