植物源性飼料添加劑對豬肉品質相關基因表達量影響研究

郭雪麗，劉澤民，王紅寶，劉一飛，溫永亮

（山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原 030032）

豬肉是我國人民生活中不可缺少的食品，隨著人們生活水平的提高，人們對豬肉已不再是量的需求，對豬肉的品質也有了較高的要求。影響豬肉品質的因素包括遺傳因素和非遺傳因素，遺傳因素是決定豬肉品質的根本。目前已發現20多個影響豬肉品質的相關基因，主要包括氟烷（Hal）基因、鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）基因、脂蛋白脂肪酶（LPL）基因、豬心型脂肪酸結合蛋白（H-FABP）基因、MyoD基因等[1-2]。根據相關文獻[3-4]，豬心型脂肪酸結合蛋白（HFABP）基因是影響豬肉品質的主要候選基因，脂蛋白脂肪酶（LPL）是影響動物機體組織脂肪沉積過程的關鍵酶，豬肌肉的生長過程中蛋白質的更新有鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）基因參與，MyoD基因能夠控制豬肉肌纖維的發育。

長期以來，抗生素、化學藥品等的毒副作用以及耐藥性嚴重影響了養殖業的發展，尤其是藥物殘留問題，威脅著人類的健康，已成為一個全社會關注的問題。植物源性飼料添加劑的毒副作用小，無耐藥性，不會在畜產品中產生有害殘留，是植物源性飼料添加劑的一個獨特優勢，這一優勢順應了時代潮流，滿足了人們回歸自然、追求綠色食品的愿望。總的來說，植物源性飼料添加劑具有來源天然性、功能多樣性、安全可靠性、經濟環保性等特點。合理組配的植物源性飼料添加劑常常具有多種功能，這些性能與作用是化學物質不可比擬的。

本研究于2019年6月至12月在山西省大同縣春源生態養殖專業合作社進行，通過植物源性飼料添加劑組方飼喂山西地方品種試驗豬，利用熒光定量PCR技術對試驗豬的脂肪酸結合蛋白（HFABP）、鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、肌細胞生長素（MyoG）、糖激酶同工酶基因（HK）、ATP合成酶（ATP5B）、磷酸果糖激酶（PFK）7個肉質相關基因進行了測定，對其表達量進行了分析研究，以探討植物源性飼料添加劑對豬肉品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 試驗豬 晉陽白豬、山西黑豬各36頭，共72頭。體重約15 kg左右，由大同縣春源生態養殖專業合作社提供。

1.1.2 試劑

（1）植物源性飼料添加劑組方Ⅰ：主要由黃芪、黨參、白術等按一定比例混合制成；植物源性飼料添加劑組方Ⅱ：主要由白術、黨參、蘇子、陳皮、神曲等按一定比例混合制成。植物源性飼料添加劑原料購自河北省安國市祁瑞中藥材有限責任公司，并由該公司將原料制成超微粉劑，粉劑粒度300目以上。

（2）Trizol提取試劑盒；4S Red Plus核酸染色劑；瓊脂糖。氯仿：異戊醇（24∶1）；無水乙醇；DEPC H2O。由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

（3）第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase，Thermo Scientific EP0733）。由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.1.3 儀器 SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠）；HC-2518R高速冷凍離心機（安徽中科中佳儀器有限公司）；DYY-6C型穩壓穩流電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；H6-1微型電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠）；FR980凝膠成像系統（上海復日科技有限公司）；TU-1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；PCR反應擴增儀（BIO 公司）；移液器（范圍 100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL； 加拿大 BBI 公司）；LightCycler480 Software Setup（Roche羅氏）。

1.2 方法

1.2.1 試驗豬飼養及采樣方法 選擇體重無顯著差異的山西黑豬、晉陽白豬各36頭，每個品種豬均分為4個處理，每個處理3個重復，每個重復3頭試驗豬。4個處理分別為植物源性飼料添加劑Ⅰ組、植物源性飼料添加劑Ⅱ組、抗生素組、對照組。植物源性飼料添加劑Ⅰ組在基礎飼糧中加入1%的植物源性飼料添加劑組方Ⅰ；植物源性飼料添加劑Ⅱ組在基礎飼糧中加入1%的植物源性飼料添加劑組方Ⅱ；抗生素組在基礎飼糧中添加金霉素，添加量50 g/t；對照組只飼喂基礎飼糧。各組預試期均15 d，正式試驗期均120 d。

達到試驗天數后，每組選3頭豬禁食12 h，自由飲水，然后屠宰。屠宰時取背最長肌胸段（第8肋骨至第1腰椎處），所取樣品用錫紙包好，裝入凍存管，標號后立即放入液氮，送實驗室轉入-80℃冰箱保存。

1.2.2 引物設計 利用Primer Premier 5.0軟件設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表1。

表1 引物序列

1.2.3 RNA抽提及檢測 DNAseI編號是B300065-0001；洗液DW的編號是B900042-1000；Buffer RDD是用來配DNA酶的，編號是B900042-1000。DNA酶的配制：DNA 酶 30 μL，加 RDD 40 μL，加 DEPC水 10 μL；DW 洗液的配制：DW∶無水乙醇=9∶1。

樣品準備：將樣品剪碎后直接在Trizol中研磨，15～25 mg樣品組織加入0.5 mL Trizol，用勻漿器勻漿處理。將勻漿液室溫放置5～10 min，使得核蛋白與核酸完全分離。加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩30 s，室溫放置3 min。12 000 r/min 4℃離心10 min。吸取上層水相轉移至干凈的離心管中，加入1/2倍體積無水乙醇，混勻。將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加至吸附柱中，靜置 2 min，12 000 r/min離心3 min，倒掉收集管中廢液。

將吸附柱放回收集管中，加入500 μL rpe Solu－tion，靜置 2 min，10 000 r/min 離心 30 s，倒掉收集管中廢液，并重復該步驟1次。將吸附柱放回收集管中，10 000 r/min離心2 min。將吸附柱放入干凈的1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加入30 mL DEPC-treated ddH2O，靜置 5 min，12 000 r/min 離心 2 min，將所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后續試驗。

1.2.4 反轉錄 按照第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase，Thermo ScientificTMEP0733）的要求進行反轉錄。在冰浴的nuclease-free PCR管中加入以下試劑：Random Primer p（dN）6（100 pmol）1 μL，dNTP Mix（0.5 mM final concentration）1.0 μL，Rnase-free ddH2O 定容至14.5 μL。輕輕混勻后離心3～5 s，反應混合物在65℃溫浴5 min后，冰浴2 min，然后離心3～5 s。將試管冰浴，再加入下列試劑：5*RT Buffer 4.0 μL，Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor（20 U）0.5 μL， RevertAid Premium Reverse Transcriptase（200 U）1.0 μL，輕輕混勻后離心 3～5 s。 在 PCR 儀上按照下列條件進行反轉錄反應：1）25℃孵育10 min；2）cDNA 合成 50 ℃ 30 min；3）終止反應 85 ℃5 min，處理后，置于冰上放置。將上述溶液-20℃保存。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 將cDNA樣品稀釋8倍作為模板上機檢測。反應體系和反應條件見表2和表 3。 20 μL 反應體系：SybrGreen qPCR Master Mix（2◇）10 μL；10 μmol/L 的上游引物和下游引物各 0.4 μL；DNA 模板 2 μL；ddH2O 7.2 μL。反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性7 s，57℃變性10 s，變性72℃變性15 s，45個循環。將加好樣品的96/384孔板放在LightCycler480 Software Setup（Roche羅氏）中進行反應。

表2 反應混合液

表3 PCR循環條件

1.3 數據統計分析

試驗數據用Microsoft Excel 2013記錄并整理，采用 2-（△△Ct）法計算反轉錄結果。 運用 IBM SPSS Statistics 22程序對整理好的數據進行方差分析和鄧肯氏多重比較，結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

試驗豬肉質相關基因熒光定量PCR測定分析結果見下表4。

表4 豬肉質相關基因熒光定量PCR分析結果

通過以上對試驗豬肉質相關基因熒光定量PCR測定結果數據分析可知，使用植物源性飼料添加劑的試驗豬，其各相關基因的表達量均極顯著高于對照組（P<0.01），并極顯著高于抗生素組。植物源性飼料Ⅱ組又極顯著高于植物源性飼料Ⅰ組（P<0.01）。山西黑豬植物源性飼料Ⅱ組中H-FABP基因、LPL基因表達量顯著高于晉陽白豬（P<0.05），其余各基因均為晉陽白豬高于山西黑豬。

3 討論

本研究說明，植物源性飼料添加劑對豬肉品質的改善有著較好的促進作用，抗生素的不當應用會影響豬肉品質。從本研究的整體來看，植物源性飼料Ⅱ組，即白術、黨參、蘇子、陳皮、神曲等按一定比例的配制提升豬肉品質效果更強，對晉陽白豬的肉質提升效果更好。

本研究主要對豬肉品質相關基因H-FABP、CAST、LPL、MyoG、HK、ATP5B、PFK 進行了測定。H-FABP屬脂肪酸結合蛋白（Fat acid binding proteins,FABPs）的家族之一，主要存在于骨骼肌、心肌、泌乳的乳腺及脂肪酸中[5-6]，參與細胞內脂肪酸的運輸，與豬肉的肌內脂肪含量相關。豬肉的品質與肌內脂肪（Intramuscular fat,IMF）密切相關[7]，近年來研究認為H-FABP是與豬肉品質研究的主要候選基因[3-4]。CAST是一種內源性專一抑制鈣蛋白酶活性的蛋白，主要參與機體的成長和代謝過程[8]，其基因的產物參與豬肌肉生長過程中蛋白質的更新[9]；是影響肌肉生長和宰后肉嫩化的一個重要因素，屠宰后可抑制鈣蛋白酶的活性，降低蛋白質水解[10]。肉的嫩度是肉品質的一個重要方面。研究發現，鈣蛋白酶系統在肉的嫩化，改善肉質中起著重要的作用[11]。LPL的主要作用是能促進沉積動物組織中的脂肪，將動物血液中的低密度脂蛋白以及乳糜微粒攜帶的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸，提供脂肪組織合成甘油三酯的原料。在動物的脂肪代謝中起著關鍵性作用[12]。MyoG主要通過調節肌肉分化階段特異性蛋白的表達來參與肌細胞決定和分化，在肌肉分化過程中起關鍵作用，也是影響豬肉品質的一個重要基因[13-17]。HK、ATP5B、PFK對豬肉品質的改善均有一定的輔助作用[18-19]。