Rhodopseudomonas capsulate誘變利用木糖與酚轉化秸稈制飼料

李國強，羅平，康佳煒，胡瑞舟，張健*

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都， 610039)2(宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓， 644000)

玉米秸稈含大量粗纖維，總糖，還含有少量蛋白質、VD、礦物質和脂肪，是一種具有廣泛應用前景的可再生資源[1-3]。國內對玉米秸稈的利用研究主要集中在生產沼氣、堆肥、還田等方面[4-6]，作為飼料加工的不到10%。因其蛋白含量低、粗纖維含量高等缺點，只能用于反芻動物飼養和畜禽的輔助用料[7-8]。能有效地利用秸稈進行加工轉化，生產優質的單細胞蛋白飼料已成為飼料研究熱點。但秸稈結構復雜難以降解，需通過預處理提高降解率。稀酸法在秸稈預處理中應用較多，但會生成大量不能被多數微生物利用的木糖，此外生成的酸、酚類、醛類等物質會抑制微生物發酵，極大限制了微生物發酵轉化秸稈的效率。目前主要采用混菌發酵、增加接種量和延長發酵時間等方法來避免發酵抑制因子對發酵造成的不良影響[9]，但存在工藝復雜、成本高和發酵周期長等缺點。因此選育出能利用或耐受發酵抑制因子和高效利用木糖的菌株對秸稈飼料化具有重要經濟價值。

莢膜紅假單胞菌菌體蛋白高(質量分數60%以上)，含胞外免疫多糖、類胡蘿卜素、維生素等物質[10-12]。廣泛應用于凈化水質、生物制氫，又因其營養價值高、綠色安全可作為餌料添加劑，在防止魚蝦疾病和促進生長等方面表現良好[13-14]，是生產蛋白飼料的理想菌株。但目前尚無利用莢膜紅假單胞菌發酵轉化玉米秸稈產單細胞蛋白飼料的研究報道。以莢膜紅假單胞菌為出發菌株篩選出高效利用木糖、苯酚的誘變菌株，提升菌株對秸稈降解產物的利用率，提高菌體蛋白產量，將秸稈轉化為飼料。對解決我國飼料源短缺的現狀，減少木質纖維原料的浪費，降低焚燒秸稈對環境帶來的污染等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與菌種

采集四川宜賓南溪區收獲玉米籽實后的玉米秸稈，剪至5～8 cm，80 ℃烘干，粉碎過40目篩。

莢膜紅假單胞菌,購于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號1.1737。

1.1.2 設備與儀器

F800纖維測定儀、SOX500脂肪測定儀，海能儀器；Kjeltec 8400凱氏定氮儀，FOSS。

1.1.3 培養基

種子培養基 (g/L)：NaHCO31.0，KH2PO41.0， Na2SO30.1，MgSO4·7H2O 0.01，CaCl20.000 5，FeSO4·7H2O 0.001，NH4Cl 1.0，酵母膏1.0，蛋白胨1.0，乙酸鈉5.0，pH 7.0。

選擇培養基：去除種子培養基中的碳源，以木糖或苯酚為唯一碳源。

以上培養基使用前121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變與選育

誘變參照文獻[15-16]。

將經誘變后的菌液誘導培養24 h后，吸取0.1 mL稀釋液涂布相應選擇培養基上，28 ℃培養24～72 h。挑取長勢好的菌落，劃線純化，連續傳代10次后保存。

1.2.2 試驗流程

原料預處理：稱取100 g玉米秸稈用0.75%稀H2SO4調整固液比為1∶5后轉至1.5 L不銹鋼管式反應器中150 ℃酸化1 h，得酸化糟，隨后加入10 mL濃氨水100 ℃處理2 h，得氨化糟，加0.8%(體積分數)氨水調節pH到5.0，加纖維素酶至200 U/g 物料，50 ℃，120 r/min搖床水解72 h得酶處理糟。

發酵劑制備：采用三級培養工藝，將1.2.1節保存的菌株按2.4×109個/mL接種量接種于酶處理糟中，28 ℃培養5 d，為一級培養。一級培養后的菌液按1.5×109個/mL接種于酶處理糟中，培養條件不變，為二級培養，以二級培養后的菌液按6×108個/mL接種于酶處理糟中為三級培養，以三級培養液作為發酵劑。

接種發酵：酶處理糟按一定接種量接種誘變菌株發酵劑，加入無菌水，控制一定的料水比，在適宜的溫度、搖床轉速、糟層厚度條件下發酵數天，每日用0.8 %(體積分數)的氨水調整pH為7.0。烘干測定各項指標。

1.2.3 研究內容

誘變劑對誘變菌株的影響。以0、0.5%、1%、1.5%、2%和3%甲基環酸乙酯以及0、20、40、60、80 和120 s紫外線照射時間誘變莢膜紅假單胞菌，按公式(1)計算致死率：

(1)

式中：m，空白對照組菌落數；n，誘變后再生菌落數。

誘變菌去除苯酚和木糖能力測試。1.2.1中保存的菌株按3×107個/mL接種量于100 mL以木糖、苯酚為唯一碳源的培養液中培養，測定接種0、24、48、72 h后計算誘變菌株對木糖、苯酚的去除率，按公式(2)計算去除率：

(2)

式中：R，苯酚或木糖去除率，%；m0，接種前培養液苯酚或木糖含量，mg；m1，接種一段時間后培養液中苯酚或木糖含量，mg。

單因素實驗。按1.2.2流程所示，在黑暗件下以溫度(27、28、29、30、31、32 ℃)、發酵時間(2、3、4、5、6、7 d)、接種量(3%、5%、7%、9%、11%、13%)、糟層厚度(1、2、3、4、5、6 cm)、搖床轉速(100、110、120、130、140、150 r/min)、料水比(g∶g)(1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13)6個因素，每個因素6個水平做單因素試驗。測定粗纖維素和真蛋白質因發酵條件變化引起的含量變化。

3.2 地草地螟、蚜蟲防治：用20%殺滅菊酯乳油2000倍液～3000倍液，或2.5%敵殺死乳油倍液2500倍液～3000倍液，或2.5%功夫乳油2500倍液～3000倍液均勻噴霧。

正交試驗。根據1.2.3中選取6因素最佳工藝參數作為參考，選取溫度(29、30、31 ℃)、發酵時間(4、5、6 d)、接種量(8、10、12%)、糟層厚度(3.5、4.0、4.5 cm)、搖床轉速(110、120、130 r/min)、料水比(1∶8、1∶9、1∶10)進行正交試驗優化。以最佳條件組合重做驗證試驗，測定樣品指標。

1.2.4 分析方法

木糖、苯酚含量測定分別參照管斌等[17]、GAO等[18]的實驗方法。白酒丟糟與發酵干糟真蛋白含量測定參照沉淀法[19]與凱氏定氮法[20]；菌落計數采用平板計數法，丟糟與發酵干糟粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纖維、水分測定分別按“中華人民共和國國家標準”GB/T 6432—94、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6434—2006、GB/T 6435—2006執行，作圖、正交試驗設計及顯著性分析分別用Excel 2010和SPSS 21.0。

2 結果與分析

2.1 誘變劑對菌株的影響

不同濃度的甲基環酸乙酯致死率分別為0、10.63%、36.87%、52.43%、75.27%和99.43%。不同紫外線照射時間的致死率分別為0、3.67%、19.12%、48.67%、88%和100%。選擇致死率在50%左右的誘變劑量誘變，即1.5%甲基磺酸乙酯、紫外線照射60 s進行復合誘變，篩選獲得1株菌落直徑大，長勢好的菌株記為FJM。

2.2 誘變菌株木糖、苯酚利用率測定

由表1可知，JM在接種72 h后對木糖去除率為92.54%，菌株FJM對木糖的去除率較原菌株有小幅提升。JM和FJM接種24 h后對400 mg/L苯酚去除率分別為5.53%和89.87%，當苯酚質量濃度達600 mg/L接種72 h后苯酚去除率分別為5.28%和97.73%，FJM菌株相較原菌株顯示其高濃度耐受和高除去率的優勢。當苯酚質量濃度達到800 mg/L時誘變菌株和原菌株均達到抑菌濃度。

表1 誘變菌株與原菌種對木糖和苯酚利用率測定結果

注：JM為莢膜紅假單胞菌，FJM為誘變的莢膜紅假單胞菌突變菌株

2.3 單因素試驗

如圖1所示，發酵2～5 d真蛋白含量顯著(P<0.05)上升達18.46%，粗纖維顯著下降(P<0.05)至15.51%。之后隨著發酵延續，發酵液達最大生物濃度，真蛋白和粗纖維含量變化不明顯(P>0.05)。

如圖2所示，27～30 ℃真蛋白含量隨發酵溫度提升而提高(P<0.05)，達18.56%，粗纖維顯著下降(P<0.05)至15.51%。之后隨著發酵溫度的繼續提升，光合細菌生長受到抑制，真蛋白含量逐漸下降。粗纖維含量隨著發酵溫度的上升逐漸下降，當溫度到達31℃后粗纖維含量無明顯變化(P>0.05)。隨著溫度的繼續上升菌株生長受到抑制。

圖1 發酵時間對秸稈真蛋白和粗纖維含量的影響

如圖3所示，接種量為1.5×108～3.3×108個/mL時接種量小，菌體基數小增長慢，真蛋白含量隨接種量的增加含量逐步提升(P<0.05)，之后繼續增加接種量，菌體增長達最大，真蛋白含量提升不明顯(P>0.05)。接種量對發酵糟粗纖維含量影響較小(P>0.05)。

圖3 接種量對秸稈真蛋白和粗纖維含量的影響

如圖4所示，料水比值為1∶8～1∶10時，正蛋白明顯上升(P<0.05)，料水比值繼續增大時真蛋白含量明顯下降(P<0.05)。當料水比值低時，發酵液含水含量低、溶氧量低不利于光合細菌生長。當料水比值高時，發酵液中營養物質濃度低同樣不利于光合細菌生長繁殖。粗纖維含量呈先上升后下降的趨勢。

圖4 料水比對秸稈真蛋白和粗纖維含量的影響

如圖5所示，隨糟層厚度的增加真蛋白含量呈先上升后下降的趨勢(P<0.05)，粗纖維呈先下降后上升的趨勢(P<0.05)。當糟層較薄時振蕩劇烈，影響菌體生長，當糟層較厚時振蕩程度減弱，溶氧量減少，不利于菌株的避光好氧生長。

圖5 糟層厚度對秸稈真蛋白和粗纖維含量的影響

如圖6所示，真蛋白含量隨搖床轉速的提升呈先上升后下降的趨勢(P<0.05)，當搖床轉速低時，發酵液中溶氧量低，限制了菌株的避光好氧生長。粗纖維含量隨搖床轉速的升高呈先下降后上升的趨勢。

圖6 搖床轉速對秸稈真蛋白和粗纖維含量的影響

2.4 正交試驗結果

由表2發酵正交試驗，各因素水平的均值和極差可知，最佳條件組合為糟層厚度4.5 cm、接種量8%、料水比值10、搖床轉速120 r/min、發酵溫度31 ℃、發酵時間6 d；因素對發酵糟真蛋白含量影響為搖床轉速(2.52)>發酵溫度(1.94)>糟層厚度(1.48)>發酵時間(0.92)>接種量(0.64)>料水比(0.36)，按以上正交試驗的最佳組合，重新接種發酵3 次，測定各項指標后對比發酵前玉米秸稈及原菌種發酵糟物質含量。

表2 正交試驗結果

注：料水比為方便展示，上表以值的方式顯示,即料水比1∶8顯示為8

由表3可知，營養成分對比可見，在高溫、酸性條件下秸稈纖維結構被破壞，秸稈中超過80%半纖維素，少部分纖維素和木質素降解[21]，之后加酶水解，粗纖維降低20.76%，灰分上升0.12%。之后加氨水中和使粗蛋白上升2.71%。接種夾膜紅假單胞菌發酵后粗蛋白上升15.6%、真蛋白上升13.62%、粗脂肪上升1.2%、因無機鹽離子被消耗灰分下降0.44%。接種誘變菌株FJM發酵后粗蛋白上升18.72%、真蛋白上升18.85%、粗脂肪上升1.82%、灰分降低0.49%，發酵糟的含水率為9.97%，顯著提了高玉米秸稈飼用價值。

表3 預處理前后玉米秸稈與不同發酵糟的營養成分對比

3 討論

近年，利用工農業廢棄物生產單細胞蛋白的研究已相繼報道[22-23]，季彬等[24]用綠色木霉發酵玉米秸稈，使粗蛋白上升至17.3%，粗纖維下降至19.6%，但粗蛋白含量低，粗纖維含量高，達不到飼用要求。張阿強[25]用黑曲霉和產朊假絲酵母混菌分步發酵玉米秸稈，發酵結束后粗蛋白和真蛋白含量分別為30.93%和16.2%，雖粗蛋白上升較大但真蛋白含量較低，飼用價值較低。

莢膜紅假單胞菌是一種對魚蝦有益、營養價值高、綠色安全的微生物，在單細胞蛋白飼料生產中具有極大的潛力[26]。前人研究結果表明莢膜紅假單胞菌能利用葡萄糖，但不能利用五碳糖和酚類。本試驗獲得的能高效利用木糖和苯酚的菌株FJM，能有效利用玉米秸稈降解的第二大產物五碳糖和稀酸預處理產生的酚類物質。充分利用玉米秸稈的降解產物供自身生長繁殖而不受發酵抑制因子的影響，從而將玉米秸稈降解產物轉化為菌體蛋白，因此使玉米秸稈真蛋白含量從5.02%提升至23.87%。發酵結果顯示，粗蛋白含量提升至32.37%，高于邱宏端等[27]以莢膜紅假單胞菌發酵轉化醬渣，使粗蛋白提升至22.7%的研究。真蛋白含量提升374%，高于ZHANG等[28]用深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)發酵經預處理后的稻草秸稈，發酵后真蛋白含量提升286%的研究。曾宇等[29]利用嗜酸紅假單胞菌(Rhodospirillumacidophila)和類球紅細菌(Rhodospirillumsphaeroides)發酵氨化預處理的玉米秸稈，實現了利用光合菌轉化玉米秸稈的目的，但存在纖維素含量高、蛋白質含量低等缺點。鑒此，采用誘變菌株FJM發酵經稀酸、氨化、酶解3種方法聯合處理后的玉米秸稈，使秸稈粗纖維降低61.5%。較前人研究粗蛋白、真蛋白提升更大，粗纖維含量更低，此外，還較低水平提高粗脂肪，降低粗灰分。顯示出誘變菌株FJM對玉米秸稈飼料化的顯著優勢。但該菌株自身不能利用木質纖維原料中的粗纖維組分，致使原料預處理存在工藝復雜，消耗大量的人力物力，成本較高等缺點。因此如何篩選出既能高效降解玉米秸稈粗纖維組分，自身又富含蛋白質等營養物質，且營養需求低的微生物是未來秸稈飼料化研究的主要方向。