釀酒酵母與產香酵母混合發酵鴨梨酒工藝條件優化

袁曉龍，邊名鴻，劉茗銘，鄒玉鋒，許強

1(四川輕化工大學，四川 宜賓，644005)2(陜西科技大學，陜西 西安，710021)

鴨梨是我國優良水果品種之一，其種植面積廣，肉質細嫩，清甜多汁，營養豐富，是釀制果酒的良好原料[1]。然而目前市售梨酒普遍存在果香較淡、風味不足的問題，因此如何豐富鴨梨酒的風味提高品質是生產亟待解決的問題[2]。

果酒的風味不僅取決于品種和釀造工藝，而且與酵母等微生物特性密切相關[3]。目前果酒釀造大多采用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)發酵，單一的發酵模式在追求高酒精度的同時，也出現果酒風味同質化的現象[4-5]。近年來大量的研究表明,非釀酒酵母在果酒釀造過程中起著積極的作用，能產生大量酯類、高級醇、甘油等代謝產物，起到增香、豐富口感以及降低酒度的作用。不同的非釀酒酵母對于果酒的發酵有不同的表現，產生不同的代謝產物，與釀酒酵母的相互作用也不同，有研究發現在櫻桃酒發酵過程中釀酒酵母會導致美極梅氏酵母MJS22早期死亡，而對德布爾有孢酵母Alpha的生長沒有影響[6]。非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵釀制果酒受到越來越多研究學者的關注，但針對鴨梨酒釀造的研究較少[7-9]。

本研究擬從6株產香酵母中優選1株產香酵母與釀酒酵母協同發酵釀制鴨梨果酒，并優化發酵條件，以期為產香酵母和釀酒酵母混菌發酵鴨梨果酒工藝提供一定的數據支持，同時為鴨梨果酒特色釀造菌劑的開發提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鴨梨采用河北省石家莊優質鴨梨；白糖、SO2(食品級)，市售。安琪葡萄酒果酒專用酵母A(SY酵母)，購于安琪酵母股份有限公司；6種產香酵母B(異常畢赤酵母(Pichiaanomala))、C(扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera))、D(異常漢遜酵母(Hansenulaanomala))、E(產阮假絲酵母(Candidautilis))、F(葡萄汁有孢酵母(Hanseniasporauvarum))和G(異常畢赤酵母(Pichiaanomala))，保藏于釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室。

1.2 儀器與設備

PHSJ-3F手持pH測定儀，上海精密科學儀器有限公司；WZ101手持糖度儀，海南博漢森科技開發有限公司；0/30 μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國supelco 公司；7890A型氣相色譜質譜聯用儀,美國安捷倫科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鴨梨酒發酵工藝流程

鴨梨就發酵工藝流程如下：

1.3.2 發酵工藝單因素試驗

初始糖度均為18 Brix，24 ℃發酵，釀酒酵母接種量為3%，產香酵母采用PDA培養基濃縮菌懸液的形式接種,釀酒酵母干粉經30 min活化使用，測定相關理化指標。

產香酵母的確定：先接種釀酒酵母，24 h后分別接入3%的產香酵母。接種方式的確定：提前接種為先接種產香酵母B，發酵24 h后接種釀酒酵母；同時接種為釀酒酵母和產香酵母B同時接種；后接種為先接種釀酒酵母，發酵24 h后接種產香酵母B，接種量均為3%。發酵時間的確定：發酵前接種3%產香酵母B，發酵24 h后接入釀酒酵母，探究發酵時間。產香酵母接種量確定：發酵前接一定量的產香酵母B，發酵24 h后接入釀酒酵母。釀酒酵母接種時間的確定：發酵前接入2%的產香酵母B，不同時間接入釀酒酵母。

1.3.3 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，采用 Box-Behnken Design方法，感官評分為響應值，選擇對感官評分影響較為顯著的發酵時間、接種量、接種時間3個因素，通過響應面對工藝條件進行3因素3水平的試驗設計，見表1。

表1 設計試驗因素與水平

1.3.4 理化指標測定方法

可溶性固形物用手持糖度儀測定；pH用酸度計測定；酒精度和還原糖參考國標測定[10]。

1.3.5 揮發性成分分析[11]

風味物質萃取：取10 mL酒樣和100 μL乙酸丁酯(4 g/L)內標于15 mL頂空瓶，加入2.5 g NaCl，30 ℃平衡10 min，插入PDMS纖維頭，30 ℃吸附15 min，GC解析2 min，用于GC-MS分析[12]。色譜條件：色譜柱DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣He的總流速為19 mL/min；進樣口溫度230 ℃，柱溫箱的起始溫度為60 ℃，保持2 min，然后5 ℃/min升至160 ℃保持1 min，然后以10 ℃/min升至230 ℃保持1 min，最后運行31 min。質譜條件：電離方程式EI，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃,連接桿溫度150 ℃。定性：化合物的質譜圖與標準譜庫對比鑒定。半定量：峰面積比值求得。

1.3.6 鴨梨酒的感官評定標準

選擇10名果酒品評員進行品評(男女各5人，年齡20～40歲)，評分標準參考葡萄酒和果酒評分標準。

1.4 數據分析

每組試驗重復3次，試驗結果以X±Se表示，SPSS 20.0用于數據分析，Origin 8.5用于數據作圖。

2 結果與分析

2.1 最佳產香酵母的確定

由圖1可知，單菌發酵和混菌發酵的可溶性固形物、pH基本一致，單菌發酵酒精度最高為11.7%vol，但感官評價低于混菌發酵，AB混菌發酵梨酒的感官評分最高，除果香外有優雅的花香，酒香柔協。在混菌發酵時產香酵母賦予酒體復雜香氣，同時對酒精產生有一定影響。綜合考慮，選擇產香酵母B與釀酒酵母A混合發酵。

圖1 不同酵母配伍對鴨梨酒發酵的影響

2.2 接種方式的確定

如圖2所示，接種方式對酒精度、殘糖有一定影響，對pH值影響不大。提前接種、同時接種、后接種的酒精度分別為11.2%vol、11.8%vol和12.1%vol。后接種的酒精度略高于同時接種，使得釀酒酵母有足夠的生長空間和營養環境進行活躍代謝；提前接種的可溶性固形物和酒精度略低，感官評價最好，酒體協調、酒香舒適。綜合考慮，提前接種優于其他接種方式，這與王星晨等[13]研究優選產香酵母提前接種釀酒酵母進行復合發酵，提升酒體香氣結論相一致。

圖2 接種方式對鴨梨酒發酵的影響

2.3 鴨梨果酒各理化指標隨發酵時間的變化情況

如圖3所示，隨著發酵進行，混菌發酵和單菌發酵的pH、可溶性固形物都呈下降趨勢，之后趨于平緩，可溶性固形物在3～5 d下降較快，此時發酵旺盛營養物質消耗較快；酒精度在2～8 d上升明顯，8 d后趨于平緩；結合酒精生成、糖耗情況和感官評價，發酵8 d較好。此時單菌發酵酒精度為11.9%vol，混菌發酵酒精度略低為11.3%vol，可溶性固形物、還原糖略高，但香氣濃郁、酒味協調。

圖3 鴨梨果酒各理化指標隨時間的變化情況

2.4 產香酵母接種量的確定

研究表明，非釀酒酵母與釀酒酵母的接種比例顯著影響釀酒酵母及非釀酒酵母的生長從而影響其代謝活動，并影響酒體的感官質量[14]。由圖4、圖5可知，微生物的代謝繁殖產生大量酸性中間產物使pH先下降，而后中間產物繼續被利用消耗，pH緩慢上升。可溶性固形物先下降，發酵8 d后趨于平穩。發酵過程中酒精度先上升8 d后趨于平穩。發酵8 d后，2%接種量的可溶性固形物含量最低，酒精度最高。還原糖變化隨著發酵的進行逐漸降低，2%接種量的殘糖最低，同時感官評價也較高，在該接種量下微生物發酵效果好，原料利用率高。KIM等[15]利用東方伊薩酵母和釀酒酵母按不同比例同時接種，發現接種比例為1∶1時釀造的葡萄酒感官質量最好，本試驗發現接種比例為1∶1.5釀造的梨酒口感爽適、香氣也較濃郁。

a-pH;b-可溶性固形物;c-酒精度;d-還原糖

圖5 產香酵母不同接種量對鴨梨酒發酵的影響

2.5 釀酒酵母接種時間的確定

由圖6、圖7可知，釀酒酵母不同的接種時間，pH呈先下降后緩慢回升的趨勢，可溶性固形物含量和還原糖含量呈下降趨勢，酒精度先上升后趨于穩定。發酵24 h后接入釀酒酵母的酒精度最高為11.4%vol，此時感官評價最好。研究表明，在混合發酵中釀酒酵母的接種時間影響酯酶活性[16]，而酯酶可以調節酯類的合成-水解平衡狀態[17-18]，從而影響感官質量。隨著接種時間的延遲，可能由于釀酒酵母接種時間晚，產香酵母生長繁殖耗用過多營養物質，造成釀酒酵母生長繁殖不好，影響酒精的生成。

2.6 響應面優化試驗結果及分析

2.6.1 響應模型的建立與分析

響應面分析方案及結果和回歸方程的方差分析見表2、表3。

表2 響應面分析方案及結果

a-pH;b-可溶性固形物;c-還原糖;d-酒精度

圖7 釀酒酵母不同接種時間對鴨梨酒發酵的影響

擬合回歸方程為：Y=88.80+3.38A+1.50B-1.63C+2AB+0.25AC+1.50BC-10.53A2-7.28B2-5.52C2

由表3可知，回歸模型具有高度的顯著性(P<0.000 1)，此模型可對工藝參數進行分析與預測。由F值可知，混合發酵鴨梨酒感官評分影響大小順序為發酵時間(A)>接種時間(C)>接種量(B)。

2.6.2 響應曲面和等高線圖

響應面和等高線見圖8～圖10，等高線呈橢圓，交互作用顯著，等高線呈圓形，交互作用不顯著[19]。最佳發酵條件為發酵時間8 d，產香酵母接種量2%，釀酒酵母接種時間24 h，混合發酵鴨梨酒的感官評分的理論值為89分。

表3 回歸方程的方差分析表

a-等高線圖；b-響應面圖

a-等高線圖；b-響應面圖

由表4可知，混菌發酵鴨梨酒感官評價較好，果香清雅，酒香柔協持久，香味協調，與最優條件下的理論值接近，采用響應面優化混菌發酵工藝是準確可行的。

a-等高線圖；b-響應面圖

2.7 驗證試驗

通過單因素和響應面優化得出，混菌發酵鴨梨酒最佳工藝條件為產香酵母B為最佳菌株，接種方式為提前接種，發酵時間8 d，產香酵母B接種量為2%，釀酒酵母接種時間為24 h。結果見表4。

2.8 混菌發酵鴨梨酒主要風味物質分析

本試驗通過GC-MS方法對比分析了最佳混菌發酵工藝和單菌發酵工藝所得酒體的主要揮發性成分，由表5可知，單菌發酵和混菌發酵所得酒體主要的揮發性香氣物質種類分別為16種、15種，其差別主要體現在酯類物質。非釀酒酵母本身含有的豐富酶類增加了酒體的風味，通過混菌發酵可以增加酯類的含量及種類[20-21]。不同發酵方式所得酒樣揮發性成分相對含量和成分存在差異，混菌發酵辛酸乙酯相對含量較高，其具有白蘭地酒香味，正己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯相對含量也較高，己酸乙酯具有強烈的果香和酒香，并有獼猴桃、菠蘿、香蕉的香氣，癸酸乙酯具有似葡萄酒香氣，乙酸乙酯具有甜味，草氨酸乙酯是混菌發酵特有的香氣，此外酒體中還有部分醇類物質，混菌發酵酒體中的異戊醇、異丁醇含量相對較少，這有利于改善液態酒飲后上頭的問題。

表4 混菌發酵鴨梨酒的理化指標

表5 鴨梨酒香氣成分及相對含量

注：-表示未檢出

3 結論

以鴨梨為原料，采用釀酒酵母和產香酵母混菌發酵，從實驗室篩選的6株產香酵母中選出1株產香酵母與釀酒酵母共酵，探究了兩種酵母接種順序、發酵時間、接種量、接種時間對發酵的影響。在單因素試驗的基礎上，選擇發酵時間、接種量、接種時間為影響因子，以混菌發酵鴨梨酒的感官評分為響應值，采用響應面法優化混菌發酵釀造工藝。結果表明，最佳發酵工藝參數為發酵時間8 d，產香酵母和釀酒酵母接種量分別為2%、 3%，釀酒酵母接種時間為發酵后24 h。在此條件下所釀造的鴨梨酒酒精度為11.6%，可溶性固形物為5 Brix，酒體澄清透亮，果香清雅，酒香柔協持久，香味協調，具有梨酒典型的風格。通過單菌發酵和混菌發酵的GC-MS對比分析，混菌發酵總酯含量是單菌發酵的2.6倍，辛酸乙酯含量最高，正己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯含量較高，一定程度上反映了混菌發酵酒體濃郁舒適香氣的物質基礎。