西式火腿關鍵加工環節對肌原纖維蛋白結構及風味吸附能力的影響

胡可，常瑞，朱秋勁*，湯鵬宇，劉春麗，宋麗，鄧力，胡萍，何臘平，曾雪峰，葉春

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽， 550025)2(貴州大學，貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽，550025)

食品的風味是影響消費者可接受性的重要屬性，食品基質對風味的釋放與感知引起眾多學者的興趣[1]。作為食品的重要成分，蛋白質可以通過特殊的分子鍵與風味化合物相互作用，從而影響食品的風味強度[2]。國內外集中于研究影響蛋白和風味結合的潛在因素上，包括pH值[3]、離子強度和類型[4]、蛋白質氧化[5]和酶促方法[6]等，這些因素可以修飾蛋白質構象，從而影響蛋白質與風味的結合。

肌原纖維蛋白是鹽溶性蛋白，由肌動蛋白、肌球蛋白、肌動球蛋白等組成，占肌肉蛋白質的40%～60%[7]，對肉品凝膠化和乳化特性具有重要影響。西式火腿屬于低溫肉制品，相較高溫肉制品，其全程低溫生產，肉質鮮嫩營養價值高[8]。煙熏賦予肉品獨特的煙熏風味，煙熏制品常用傳統直火發煙方式煙熏，但其設備成本高、耗時長易產生苯并芘、雜環胺等有害物質[9]。因此，以綠色煙熏液為核心的液熏法在煙熏肉品領域得到推崇。煙熏液作為食品添加劑，可以調節肉品的色澤和風味，提高肉品抗氧化和抗菌性能。研究表明，煙熏液中含有大量酚類(相對含量在68.33%～82.53%)、醛類、呋喃、有機酸等化合物[10]，其中愈創木酚作為酚類物質的代表因其成分含量高、閾值較低且具有明顯熏肉風味，是煙熏液主要風味物質[11]。

盡管許多研究表明蛋白質對酮類[12]、醇類、醛類物質[13]的吸附與溫度、壓力[14]、微波、超聲等[15]因素相關，雖大多相關研究著重機理機制的探討但尚未將相關研究與食品生產加工環節有機聯系起來。事實上，在食品加工過程中，通過研究蛋白質與風味的結合，可以反映其產品風味強度，從而使食品生產商開發出具有理想風味的產品。因此，通過分析西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白結構變化，探討加工環節對蛋白風味物質吸附能力的影響，對于煙熏液在西式火腿生產中的應用具有重要的實際指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

西式火腿制作材料：新鮮豬后腿精瘦肉，購于合力超市；食鹽、白砂糖、味精、黑胡椒粉、淀粉，購于花溪沃爾瑪超市；乳酸鉀，北京清源食品添加劑有限公司；亞硝酸鹽，杭州龍山化工有限公司；三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、D-異抗壞血酸鈉，河南萬邦實業有限公司；黃原膠、卡拉膠，內蒙古阜豐生物科技有限公司；大豆分離蛋白，萬利達生物科技有限公司；硬木煙熏香味料SmokeZ C-10-12、C-10-06，美國紅箭公司。以上材料均為食品級。

尿素，天津市福晨化學試劑廠；Tris，美國Genview公司；KCl K2HPO4、(KH2PO4、KCl，成成金山化學試劑有限公司；2-硝基苯甲酸(DTNB)，上海麥克林生物化學公司；8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；β-巰基乙醇，廣東翁江化學試劑有限公司；KBr，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CP214電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司；Seven2GoTM梅特勒-托利多的便攜式pH計，瑞士；XHF-DY高速分散均質機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SpectraMAX190酶標儀，美國Molecular Devices公司；SB25-12DT超聲清洗器，上海冠特超聲儀器有限公司；VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；UV2600紫外-可見分光光度計日本，Shimadzu公司；Cary eclipse型熒光分光光度計，美國Aglient公司；GC-MS QP2010 氣相色譜質譜聯用儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 西式火腿制備

修整切塊：將從超市購買的后腿精瘦肉切成肉塊，(1 cm×2 cm×3 cm)。

腌制：按照腌制配方(質量分數)食鹽2.5%，亞硝酸鈉0.015%，異抗壞血酸鈉0.06%，多聚磷酸鈉0.1%，焦磷酸鈉0.2%，白砂糖0.8%，蒸餾水5%制作好腌液，倒入切好的肉中，充分混合均勻，置于0～4 ℃下腌制24～48 h；

真空滾揉：滾揉時間為4 h，0～8 ℃每滾揉20 min間歇10 min，滾揉在滾揉快結束時按比例加入加工配方后再繼續滾揉10 min，以保證其分布均勻。加工配方為(質量分數)胡椒粉0.5%、味精0.5%、大豆蛋白2.2%、淀粉6.5%、卡拉膠0.3%、黃原膠0.3%、紅曲紅0.01%、硬木煙熏香味料Smoke ZC-10-12型0.2%、Smoke ZC-10-06型 0.5%、乳酸鏈球菌素0.1%；

斬拌：真空滾揉結束，取25%(質量分數)肉料與斬拌機中進行斬拌，肉樣呈肉泥形態時斬拌結束；

灌腸：塑料腸衣剪開，一端打卡后排氣，操作灌腸機灌腸，每間隔約20 cm打1次卡；

蒸煮：蒸煮鍋內加入清潔水，預熱到85 ℃放入火腿，將水溫恒定在80 ℃蒸煮2 h；

冷卻：采用流水法冷卻火腿，冷卻后送入0～5 ℃冷庫保藏。

依據上述實驗室探索方法制作的西式火腿，分別在原料肉、腌制、真空滾揉、斬拌和蒸煮關鍵加工環節進行取樣。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考曹錦軒等[16]的方法。準確稱取1 g肉或火腿樣品，置于50 mL離心管中。分別加入20 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液(需預冷，pH=7.5)，12 000 r/min勻漿10 s 1次，重復3次 (冰浴)。溶液在4 ℃下，8 000 r/min離心15 min，重復上述操作3次并收集沉淀。沉淀用5 mL 50 mmol/L (含0.5 mol/L NaCl的預冷磷酸緩沖液(pH=8.0)溶解。所得溶液在4 ℃下、 5 000 r/min離心15 min，收集上清液，于4 ℃冰箱儲存并在36 h內使用。

以牛血清白蛋白作為標準，采用二辛可寧酸法測定蛋白質濃度。

1.3.3 肌原纖維蛋白巰基含量的測定

巰基總量的測定方法參考XU等[17]等的方法。20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液(含0.6 mol/L KCl, pH=7.0)將肌原纖維蛋白稀釋到4 g/L左右。

巰基總量的測定：取0.75 mL蛋白溶液于5 mL離心管中，添加2.25 mL (8 mol/L)的尿素，尿素的終摩爾濃度為6 mol/L。取20 μL (1.5 g/L)的DTNB加入到蛋白尿素混合液中。于25 ℃下恒溫孵化5 min，在412 nm處測定吸光度。未加入蛋白質的緩沖液混合體系為空白。巰基總量的計算公式如(1)所示：

(1)

式中:A412,減去空白后412 nm處肌原纖維蛋白吸光值；D,肌原纖維蛋白稀釋倍數；C,肌原纖維蛋白質質量濃度，g/L。

1.3.4 肌原纖維蛋白質表面疏水性的測定

參考BOYER等[18]的方法。吸取適量肌原纖維蛋白溶液于2 mL離心管中，用磷酸鹽緩沖液(含0.6 mol/L KCl，pH=7.0) 稀釋到1 g/L備用。準確吸取200 μL蛋白液于96孔酶標板中，以ANS為探針，準確吸取6.5 μL 0.8 mmol/L的ANS到對應的蛋白液中。全波長酶標儀參數設定如下：激發波長380 nm,發射波長475 nm，激發和發射波長的狹縫均設定為5 nm。以原料肉中肌原纖維蛋白為對照，表面疏水性計算公式如公式(2)所示：

(2)

1.3.5 肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

參考藍蔚青等[19]的方法。

1.3.6 肌原纖維蛋白內源熒光光譜分析

參考李慶舒等[20]的方法。

1.3.7 肌原纖維蛋白紫外吸收光譜分析

參考康懷彬等[21]的方法。

1.3.8 肌原纖維蛋白對4-乙基愈創木酚吸附能力的測定

4-乙基愈創木酚標品用適量1,2-丙二醇溶解，用雙蒸水調整溶液中各化合物終濃度為800 mg/kg，密封后置于-4 ℃冰箱備用。加入到試驗樣品中的4-乙基愈創木酚濃度為：0.5 g/mg，密封后于4 ℃冰箱儲存備用。

將不同關鍵加工環節的肌原纖維蛋白溶液用20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4磷酸鹽緩沖液(含0.6 mol/L KCl, pH=7.0)稀釋到質量濃度1 g/L。精準吸取5 mL混合溶液于20 mL頂空樣品瓶中，添加4-乙基愈創木酚儲備液使各4-乙基愈創木酚終質量濃度為1 mg/L。密封置于4 ℃下吸附16 h。空白組為不含蛋白而添加同等體積的磷酸鹽緩沖液。

蛋白質對4-乙基愈創木酚吸附能力用溶液中4-乙基愈創木酚自由比例相對值表示，自由比例計算如公式(3)所示；空白溶液中4-乙基愈創木酚的頂空濃度定義為100%，吸附能力計算如公式(4)所示：

(3)

肌原纖維蛋白對4-乙基愈創木酚吸附能力/%

(4)

式中:Ac,空白溶液中風味化合物的峰面積，As,白樣品溶液中風味化合物的峰面積[22]。

1.4 數據處理

每組實驗設置3次平行，結果用(x±s)表示。采用IBM SPSS Statistics 23軟件進行數據分析，數據統計方法采用ANOVA進行LSD差異分析，P<0.05表示差異顯著。Origin 2016軟件用于制圖。

2 結果與分析

2.1 西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白巰基總量變化

蛋白質巰基分為表面活性巰基和包埋于蛋白質分子內部的巰基，蛋白質中巰基與二硫鍵的形成緊密相關，二硫鍵是維持蛋白質空間結構的重要化學鍵[23]。由圖1可知，相比于原料肉，不同關鍵加工環節肌原纖維蛋白中巰基含量均有不同程度下降，在斬拌環節巰基總量最少，降低了31.3%，這可能是因為外部高速剪切作用力使蛋白質結構發生延展，導致二硫鍵斷裂，掩埋于蛋白質內部的巰基逐漸暴露至蛋白表面，引起表面巰基升高，從而使巰基總量升高[24]。蒸煮后肌原纖維蛋白巰基含量上升，這可能與高溫促使肌原纖維蛋白變性，更多的巰基基團暴露，但蒸煮是一個持續性的過程，巰基基團暴露的同時也有巰基形成二硫鍵，最終使得蛋白結構趨于穩定。

圖1 西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白巰基總量變化

2.2 西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白表面疏水性變化

蛋白質的表面疏水性是位于蛋白質表面的疏水性氨基酸的相對含量，表征蛋白質與水之間相互排斥的物理性質[25]。由圖2可知，以原料肉為對照，不同加工關鍵環節肌原纖維蛋白表面疏水性顯著升高(P<0.05)。腌制環節肌原纖維蛋白表面疏水性顯著上升，可能與腌制過程中添加的食鹽有關，NaCl使埋藏于肌原纖維蛋白分子內部的疏水性殘基暴露到表面，使得表面疏水性升高。真空滾揉環節肌原纖維蛋白表面疏水性最高(P<0.05)，相比原料肉升高了61%。推測原因為在真空環境下，間歇滾揉破壞了蛋白質的高級結構，蛋白的疏水性氨基酸如色氨酸、苯丙氨酸等殘基暴露至蛋白表面，使得表面疏水性增加[26]。斬拌和蒸煮環節的肌原纖維蛋白表面疏水性未顯示差異，說明高速剪切力與低溫蒸煮對于西式火腿中肌原纖維蛋白表面疏水性的影響無明顯差別。CHELH[27]的研究表明，隨著加熱溫度的上升和加熱時間的延長，肌原纖維蛋白的表面疏水性不斷升高。其研究中，肌原纖維蛋白的加熱溫度最高為70 ℃，加熱時間最長為60 min，而在西式火腿的蒸煮環節，蒸煮溫度為80 ℃時間2 h，在長時間蒸煮過程中，蛋白質發生變性且結構趨于穩定，故蛋白質表面疏水性并不會一直升高。

圖2 西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白表面疏水性變化

2.3 西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜圖

2.4 西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白紫外吸收光譜和內源熒光光譜分析

研究表明，蛋白質中的色氨酸 (Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基對紫外光具有吸收作用，使蛋白質具有吸收紫外光的能力[30]。如圖4所示，以原料肉中肌原纖維蛋白紫外最大吸收峰波長(λmax)為289 nm，腌制和蒸煮環節肌原纖維蛋白λmax未發生明顯偏移，分別為294和295 nm。真空滾揉和斬拌環節肌原纖維蛋白λmax分別紅移至302 nm和301nm，紅移現象的發生說明Tyr和Trp殘基周圍的微環境極性增加，表明蛋白質受到溶劑效應影響結構發生了變化，這些氨基酸殘基在經過腌制、真空滾揉和斬拌后數量增加，以更高的濃度暴露于溶劑中。蒸煮環節肌原纖維蛋白λmax降低說明氨基酸參加對紫外吸收光能力降低，λmax輕微藍移至284 nm，這說明蛋白質所處微環境發生改變。

圖4 西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白紫外吸收光譜圖

隨著不同外界作用和所處環境的變化，蛋白質構象也會產生變化，其芳香族氨基酸殘基的位置與其所處微環境也會隨之發生改變[31]。DUFOUR等[32]還利用熒光光譜檢測蛋白質與配體結合的構象變化。因此，內源性熒光光譜法可以作為研究蛋白質構象的一種方法。如圖5所示，西式火腿原料肉中肌原纖維蛋白的熒光峰位置在328 nm，腌制、真空滾揉和斬拌后熒光峰位置相對原料肉發生輕微紅移，熒光峰位置分別為335、339和340 nm，蒸煮環節肌原纖維蛋白熒光峰位置出現在334 nm。

圖5 西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白內源熒光光譜圖

2.5 西式火腿不同關鍵加工環節肌原纖維蛋白風味吸附變化

如圖6所示，不同關鍵加工環節肌原纖維蛋白對4-乙基愈創木酚的吸附作用不同，原料肉中肌原纖維蛋白4-乙基愈創木酚的自由比例為83.42%，即16.58%的4-乙基愈創木酚被肌原纖維蛋白吸附。在腌制和真空滾揉環節4-乙基愈創木酚的自由比例顯著降低(P<0.05)，真空滾滾揉環節最低為69.79%，表明真空滾揉環節肌原纖維蛋白對4-乙基愈創木酚吸附能力最強，達到30.21%。蛋白質疏水區域與風味結合有緊密聯系，驗證了表面疏水性相對較強的環節其對風味物質吸附能力較強[33]。斬拌和蒸煮環節4-乙基愈創木酚自由比例自69.79%升高至95.38%、95.04%，此時肌原纖維蛋白對4-乙基愈創木酚吸附能力顯著降低(P<0.05)。這可能與快速剪切和升高溫度導致肌原纖維蛋白結構發生變化，從而抑制了蛋白對4-乙基愈創木酚的吸附有關。

圖6 西式火腿關鍵加工環節肌原纖維蛋白吸附4-乙基愈創木酚情況

3 結論

利用光譜學和SPME-GC-MS方法，探討西式火腿不同關鍵加工環節肌原纖維蛋白結構的變化以及對煙熏液主體煙熏成分4-乙基愈創木酚吸附能力的影響。以原料肉肌原纖維蛋白為對照，各關鍵加工環節肌原纖維蛋白巰基總量均不同程度降低，斬拌環節最低，肌原纖維蛋白表面疏水性則呈不同程度升高趨勢，在真空滾揉環節最高；光譜學信息反映，肌原纖維蛋白的酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺Ⅲ帶均發生變化，其中真空滾揉環節位移明顯，真空滾揉環和斬拌節肌原纖維蛋白紫外最大吸收峰波長發生紅移，熒光峰在腌制、真空滾揉和斬拌環節也出現紅移，說明蛋白質結構在西式火腿加工進程中發生了明顯變化，其中真空滾揉環節蛋白質結構向有利于風味結合轉變；經過蛋白對4-乙基愈創木酚吸附能力實驗，發現真空滾揉后肌原纖維蛋白對4-乙基愈創木酚依附能力最強，說明相比于其他環節，真空滾揉有利于蛋白質與風味物質結合。

綜上，西式火腿不同關鍵加工環節對肌原纖維蛋白結構及對風味物質吸附能力影響不同，蛋白質構象的改變引起風味物質吸附能力不同；其中真空滾揉環節肌原纖維蛋白表面疏水性強，有更多疏水集團暴露于表面，對于4-乙基愈創木酚吸附能力最強。本研究為西式火腿生產中煙熏液的使用提供理論依據，同時對肉品加工環節與風味形成機制的探討有積極意義。