雙歧桿菌微膠囊的制備及其理化性能

李作美， 許曉云，劉琦

1(蚌埠學院 食品與生物工程學院，安徽 蚌埠,233030)2(中國科學技術大學 生命科學院，安徽 合肥, 230000)

益生菌(Probiotics)是一類對宿主有益的活性微生物，它黏附于生物腸道內，在與有害菌進行營養競爭的同時形成占位效應，可減少有害菌的定植[1-2]。其主要應用于食品、藥品及保健品等領域，除可調節人體健康外，還可應用于動物體內，在提高產量、減少病死率等方面發揮著重要的作用[3-4]。

雙歧桿菌常見于健康人體和暖血動物腸道內，可作為腸道益生菌單獨使用，也可和其他益生菌復合使用，是一種具備多種生理活性、在開發益生菌產品方面具有巨大的潛力[5]。在食品行業中，雙歧桿菌主要用于發酵乳制品的生產[6]。在藥品保健品行業中，主要是制作成微膠囊，李來酉[7]將包括雙歧桿菌在內的3種菌包埋，制作出了性能良好、儲存性質穩定的三聯菌微膠囊。另外雙歧桿菌在家畜養殖方面也能發揮一定的作用，BARBA等[8]發現，給仔豬喂食含長雙歧桿菌和乳雙歧桿菌的微膠囊后，其采食量和絨毛/隱窩的比率及回腸乙酸濃度大大提高，因腸道不適而表現出的異常反應也有所改善。

雙歧桿菌的生理活性需定植于腸道中才能被發揮出來，但雙歧桿菌對酸、氧環境極為敏感，環境因素對其的影響是不可避免的[9]。因此，國內外多將雙歧桿菌微囊化以降低其死亡率，這已成為雙歧桿菌應用研究的重要方向[10-11]。合理運用微膠囊技術和壁材，可提高包埋率與穩定性，也可將微膠囊的粒徑控制在一個合適的范圍內[12-13]。

乳化法和擠壓法在微膠囊實驗領域應用較多[14]。乳化法因鈣離子分布范圍、擴散距離和通過液相的不同而分為內源乳化法和外源乳化法，常和冷凍干燥技術相結合[15]。有研究表明前者的包埋性能要優于后者[16]，且內源乳化法制備出的微膠囊較外源乳化法來說球形度高、凹凸率低[17-18]。

微膠囊壁材種類繁多，性質各異，在壁材液中添加海藻酸鈉，可提高雙歧桿菌微膠囊在人工模擬消化液中的穩定性[19]，在對其進行理化性質檢測時表現出了良好的腸溶性[20]。以乳清蛋白作為壁材可提高微膠囊的緩沖能力[21]，還可作為菌種的凍干保護劑，提高菌在冷凍干燥過程中的存活率[22]。可在酸性環境下與海藻酸鈉發生靜電反應，彌補其大孔結構，這樣更容易攔截菌體并使菌體嵌合[23]。

本實驗采用內源乳化法，旨在優化雙歧桿菌微膠囊的制備工藝，以得到包埋率較高的濕膠囊和干膠囊；同時考察了濕膠囊和干膠囊在經過人工模擬消化液及消化道體系后的穩定性，為后續相關生產或研發奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalsssp. Lactis)，北京川秀有限公司。

1.2 培養基

改良MRS培養基，杭州百思生物科技有限公司。

1.3 試劑與儀器

海藻酸鈉、低聚果糖、乳清蛋白、CaCO3、Span-80、冰醋酸、乙酸鈉、NaCl、MRS培養基、PBS粉劑、Na2HPO4·12H2O、檸檬酸、HCl、胃蛋白酶、KH2PO4、胰蛋白酶、膽鹽等均為分析純，北京化工有限公司。

CVC FD8-5真空冷凍干燥機，Gold SIM International Group CO,LTD；H4-20KR臺式高速冷凍離心機，湖南可成儀器設備有限公司；LRH-150-Ⅱ生化培養箱，廣東省醫療器械廠；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；ZNCL-T 250磁力攪拌器，鞏義市子華儀器有限公司；JH-11-09可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.4 雙歧桿菌微膠囊的制備及單因素實驗

1.4.1 實驗材料的預處理

菌懸液的制備：將長雙歧桿菌菌種活化后進行厭氧培養，在MRS培養基中加入半胱氨酸鹽酸鹽37 ℃恒溫培養24 h，37 ℃下4 500 r/min離心15 min，收集菌泥，加入少量生理鹽水混合均勻。進行梯度稀釋，接著用平板計數法輔以血球板計數法檢測菌懸液的活菌數，保證活菌數為109～1010CFU/mL，最后將稀釋到合適梯度的雙歧桿菌置于4 ℃冰箱保存備用。

壁材液的制備：將一定質量的海藻酸鈉和乳清蛋白均勻混合于質量為10 g的pH 6.5的無菌PBS緩沖液中，在紫外燈下照射30 min，放置在無菌操作臺備用。

芯材液的制備：將低聚果糖溶解在無菌水中制成質量分數為2.6%的溶液，再將其與菌懸液按體積比1∶1混合，放置備用。

1.4.2 主要溶液的配制

0.9%生理鹽水：稱取0.9 g NaCl，溶解在少量無菌水中，定容至100 mL。

醋酸溶液：取冰醋酸11.55 mL，加無菌水定容至1 L。

醋酸鹽溶液：稱取27.22 g的乙酸鈉，加少量無菌水溶解后定容至1 L，用配制好的醋酸溶液調pH至5.5。

解囊液: 稱取為35.8 g Na2HPO4·12H2O和10.5 g的檸檬酸，加純凈水定容至1 L，攪拌使之充分溶解，調pH為7.25，121 ℃高壓滅菌20 min。

人工模擬胃液：取0.1 mol/L稀HCl溶液16.4 mL，先加適量無菌水溶解，再加胃蛋白酶10 g，最后定容至1 L，調節pH值為1.2，過0.22 μm濾膜除菌備用。

人工模擬膽鹽溶液：取10 g膽鹽溶于無菌水中定容至1 L，過0.22 μm濾膜除菌備用。

人工模擬腸液：稱取KH2PO46.8 g，先加適量無菌水溶解；同時在另一燒杯中稱取胰蛋白酶10 g，加適量無菌水使之溶解。將兩液混合后，加無菌水定容至1 L，調節pH值為7.4，過0.22 μm濾膜除菌備用。

1.4.3 雙歧桿菌微膠囊的制備方法

內源乳化法制備微膠囊的過程參照鄧玉娣等[24]、張國芳等[25]報道的方法, 并在此基礎上進行修改：將濃度不低于109CFU/mL的菌懸液與等體積的低聚果糖溶液混合均勻，制成芯材溶液，取與芯材溶液體積相同的壁材溶液，將其加入芯材溶液緩慢攪拌使之均相；將CaCO3粉末均勻地分散到該混合溶液中，然后再將此混合液乳化到含有體積分數1.0%的Span-80大豆油中(轉速為400 r/min)，15 min后，加入冰醋酸繼續攪拌，以促進冰醋酸和CaCO3的接觸反應；30 min后，再加入60 mL醋酸鹽溶液(調pH為5.5)，緩慢攪拌，靜置約2 h，離心去油，收集微膠囊，生理鹽水洗滌3次后4 ℃冰箱保存；取最優條件下的到的濕膠囊，先于-20 ℃預凍12 h，然后放入-60 ℃真空冷凍干燥機于冷凍干燥48 h，得到的凍干微膠囊-20 ℃保存[25]。

以下單因素試驗按1.4.1的標準將備用的壁材液和芯材液混合，按1.4.3的步驟在5個100 mL燒杯中進行水相的均勻分散，在5個500 mL燒杯中完成油相的攪拌，接著進行后續的操作。

1.4.3.1 海藻酸鈉的質量分數對濕膠囊包埋率的影響

海藻酸鈉質量分數分別設為1%、2%、3%、4%、5%，其余因素分別為m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)=1∶1，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，V(水相)∶V(油相)=1∶3，冰醋酸體積為400 μL。測濕膠囊的包埋率，獲得海藻酸鈉的最適質量分數。

1.4.3.2m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)對濕膠囊包埋率的影響

m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)分別設為5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5，其余因素分別為海藻酸鈉質量分數2%，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，V(水相):V(油相)=1∶3，冰醋酸體積為400 μL。測濕膠囊的包埋率，獲得乳清蛋白和海藻酸鈉的最適質量比。

1.4.3.3m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)對濕膠囊包埋率的影響

m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)分別設為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，其余因素分別為海藻酸鈉質量分數2%，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)=1∶1，V(水相)∶V(油相)=1∶3，冰醋酸體積為400 μL。測濕膠囊的包埋率，獲得CaCO3和海藻酸鈉的最適質量比。

1.4.3.4V(水相)∶V(油相)對濕膠囊包埋率的影響

V(水相)∶V(油相)分別設為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7，其余因素分別為：海藻酸鈉質量分數為2%，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)=1∶1，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，冰醋酸體積為400 μL。測濕膠囊的包埋率，獲得水相和油相的最適體積比。

1.4.3.5 冰醋酸體積對濕膠囊包埋率的影響

冰醋酸體積分別設為200、400、600、800、1 000 μL，其余因素分別為海藻酸鈉濃度為2%，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)=1∶1，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，V(水相)∶V(油相)=1∶3。測濕膠囊的包埋率，獲得冰醋酸的最適體積。

1.4.4 總菌數與包埋率的計算

1.4.4.1 總菌數的計算公式

總菌數計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A，5個中方格的總菌數；B，稀釋倍數。

1.4.4.2 包埋產率的計算公式

包埋產率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：G1，1 mL解囊液中的雙歧桿菌活菌數，CFU/mL；V1，解囊液的總體積，mL；N0，包埋前單位體積原菌液中的活菌數，CFU/mL；V0，制備微膠囊所用原菌液的體積，mL；M，所得微膠囊的總質量，g；M0，稱取微膠囊的質量，g。

1.5 響應面試驗的因素和水平

比較單因素試驗中這5個因素對濕微膠囊包埋率的影響程度，選取3個影響程度較大的因素，以包埋率為響應值，使用響應面軟件進行3因素3水平試驗，根據結果確定最優的雙歧桿菌微膠囊制備工藝條件。因素水平表如下表1所示。

表1 因素水平表

1.6 驗證試驗

為進一步考察軟件得出結果的真實性，在以上得出的最佳條件下進行試驗，接著測定雙歧桿菌濕潤微膠囊的包埋率。將試驗結果與軟件數學結果相比較，觀察差別是否明顯，試驗是否具有代表性。

1.7 雙歧桿菌濕、干膠囊的理化性能的測定

1.7.1 表征分析

將藥匙煮沸且用體積分數75%酒精消毒后置于紫外燈下通風30 min，取最佳工藝條件下制得的濕潤微膠囊與凍干微膠囊，描述粒徑大小和形態特征。

1.7.2 耐胃酸實驗

取最優條件下得到的雙歧桿菌濕膠囊1 g、凍干微膠囊0.1 g和1.4.1保存的菌懸液1 mL，分別置于9 mL人工模擬胃液中，37 ℃恒溫搖晃0、1、2 h后，棄去溶液(菌懸液不必棄去溶液)。收集微膠囊，用解囊液徹底崩解后，制成菌懸液，計數。

1.7.3 耐膽鹽實驗

取最優條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g、凍干微膠囊0.1 g和菌懸液1 mL，分別置于9 mL人工模擬膽鹽溶液中，37 ℃水浴0、1、2、3 h后棄去溶液(菌懸液不必棄去溶液)。收集微膠囊，用解囊液徹底崩解后，制成菌懸液，計數。

1.7.4 腸道釋放性實驗

取最優條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g、凍干微膠囊0.1 g和菌懸液1 mL，分別置于9 mL人工模擬腸液中，放在恒溫搖床中。將其溫度調節為37 ℃，搖速設置成210 r/min，0、30、60、90 min后，直接吸取3～4 mL溶液，在波長600 nm處測吸光度。

1.7.5 模擬消化道體系實驗

取最優條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g、凍干微膠囊0.1 g和菌懸液1 mL，分別置于人工模擬胃液中處理1 h，然后轉移至人工模擬膽鹽溶液中處理30 min，最后將各實驗組置于人工模擬腸液中處理45 min，棄去溶液(菌懸液不必棄去溶液)。收集微膠囊，用解囊液徹底崩解后，制成菌懸液，計數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗的結果與分析

2.1.1 海藻酸鈉質量分數對濕膠囊包埋率的影響

由圖1可知，當海藻酸鈉質量分數從1%升至2%時，雙歧桿菌微膠囊的包埋率提高了約10%，后又逐漸下降。當質量分數<2%時包埋率較低，原因是此時形成的囊壁較薄，機械強度較弱，微膠囊容易破裂導致菌體流出[26]；當質量分數>2%時包埋率緩慢下降，這是因為隨著海藻酸鈉質量分數的增大，壁材液密度和黏度也變大，不利于菌體的分散和包埋[27]。綜上所述，海藻酸鈉的最適質量分數為2%。

圖1 海藻酸鈉質量分數對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響

2.1.2 乳清蛋白與海藻酸鈉的比值對濕膠囊包埋率的影響

由圖2可知，雙歧桿菌微膠囊的包埋率先急劇增大，后又急劇減小，當m(乳清蛋白):m(海藻酸鈉)為1∶1時包埋率達到最大值。當二者質量比值較大時，乳清蛋白較多，形成的蛋白質網過大、過于疏松，且粘連度較高，不利于形成規格一致的微膠囊；當二者質量比值較小時，乳清蛋白在溶液中含量太低，與Ca2+和海藻酸鈉交聯程度均不足，雙歧桿菌包埋得不充分[28]。乳清蛋白與海藻酸鈉復配作為雙歧桿菌微膠囊壁材，當pH值低于乳清蛋白的等電點時，乳清蛋白的靜電荷為正，與帶負電荷的海藻酸鈉多糖產生靜電相互作用，從而形成牢固的微膠囊膜結構，可對雙歧桿菌提供一定程度的保護作用。綜上所述，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)最適為1∶1。

圖2 m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響

2.1.3m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)對濕膠囊包埋率的影響

由圖3可知，雙歧桿菌微膠囊的包埋率先急劇增大，后逐漸下降，當m碳酸鈣∶m海藻酸鈉為1∶2時微膠囊的包埋率最大。CaCO3質量分數較大時，與海藻酸鈉及乳清蛋白的結合位點較多，因此包埋率會有一個飛躍過程；m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)<1∶2時，隨著碳酸鈣質量的增大，溶液滲透壓不斷上升，這可能會對整個微膠囊體系造成損傷，使得包埋率降低。綜上所述，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)最適為1∶2。

圖3 m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響

2.1.4V(水相)∶V(油相)對濕膠囊包埋率的影響

由圖4可知，雙歧桿菌微膠囊的包埋率呈先出增大、后減小、最后趨于平緩的趨勢，當V(水相)∶V(油相)為1∶3時微膠囊的包埋率最大。分析可能是大豆油體積較小時，微膠囊之間摩擦力較大，表面不平整，影響包埋率；而當大豆油體積過大時，摩擦力減小，無法均勻菌體和壁材液，且會造成微膠囊粒徑過大的現象，因此包埋率也會降低。綜上所述，V(水相)∶V(油相)最適為1∶3。

圖4 V(水相)∶V(油相)對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響

2.1.5 冰醋酸體積對濕膠囊包埋率的影響

由圖5可知，隨著冰醋酸體積的增加，雙歧桿菌微膠囊的包埋率浮動很小，當冰醋酸體積為400 μL時包埋率最大。可能是因為微量的冰醋酸即可引發CaCO3的解離，但當體積<400 μL時，還有部分碳酸鈣未被解離，這就造成了包埋率偏低；當冰醋酸繼續增加時，溶液的pH降低，對微膠囊囊壁造成輕微的影響，間接影響了包埋率。綜上所述，冰醋酸的最適體積為400 μL。

圖5 冰醋酸體積對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗優化的結果

用Design-Expert.8.0軟件處理表2中的數據，得回歸方程：R1=79.5-0.98A+0.84B+1.63C-0.61AB+3.5AC-2.39BC-2.19A2-0.96B2-3.56C2。所得回歸方程方差分析如表3所示。

2.2.2 響應面試驗交互作用分析

運用 Design-Expert.8.0 軟件對各因素之間的交互作用進行模型圖分析，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)，V(水相)∶V(油相)與包埋率之間的相互作用，結果表明各因素對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響程度為V(水相)∶V(油相)>m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉) >m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)。

表2 響應曲面試驗結果

表3 回歸方程方差分析

2.2.3 驗證試驗結果

通過軟件優化數值分析得出雙歧桿菌微膠囊制備的最佳工藝，為方便操作，將其修正成m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)= 2∶1，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，V(水相)∶V(油相)=2∶5。理論上雙歧桿菌微膠囊包埋率可達80.15%，在此條件下進行驗證試驗，平行3次。實際得到的雙歧桿菌微膠囊包埋率為80.11%，與最佳提取工藝的理論值差別較小，說明該模型優化的最佳提取工藝具有較高的應用價值。

2.3 雙歧桿菌濕、干膠囊理化性能的測定

2.3.1 表征分析結果

最優條件下濕膠囊為不透明微黃色顆粒狀，用顯微鏡觀察干膠囊的表面，發現出現皺縮狀態，且因其粒徑較小和保存不完善而造成輕微的粘連；將濕膠囊分散到無菌生理鹽水中可發現其形態圓潤、大小較為均一。單因素試驗時發現直徑約為2.8 cm的攪拌子制作出的微膠囊粒徑均一性差，分析可能是由于其直徑較小而使得攪拌時作用力弱；后續實驗均采用直徑約3.5 cm的攪拌子，此問題得以改善。

2.3.2 耐胃酸實驗結果

如圖6所示，未被包埋的菌懸液被模擬胃液侵蝕1 h后，其活菌數迅速下降至國際標準以下，放置2 h后再測量其活菌數，又下降了3個對數級，菌活力幾乎喪失殆盡。濕潤微膠囊和凍干微膠囊的活菌數也出現下降，但幅度較小，2 h后活菌數仍在1×106CFU/mL以上，說明此微膠囊性能良好，對胃酸有一定的抵御能力。濕潤微膠囊活菌數的下降幅度略小于凍干微膠囊，這可能是因為凍干微膠囊的囊壁在凍干后皺縮，影響了微膠囊的囊壁結構。

圖6 菌懸液和微膠囊在人工模擬胃液中活菌數的變化

2.3.3 耐膽鹽實驗結果

如圖7所示，菌懸液、濕潤微膠囊和凍干微膠囊在模擬膽鹽溶液中37 ℃水浴3 h后活菌數均有所下降。其中菌懸液中活菌數下降的最多，濕潤微膠囊次之，凍干微膠囊最少。這是因為微膠囊的囊壁緩沖了膽鹽對菌體的傷害，且凍干微膠囊溫度較低。此外，三者在膽鹽的作用下活菌數下降均不顯著，這可能是因為膽鹽主要起分解脂肪的作用，雙歧桿菌菌體和微膠囊壁材對其并不敏感。

圖7 菌懸液和微膠囊在人工模擬胃液膽鹽溶液中活菌數的變化

2.3.4 腸道釋放性實驗結果

如圖8所示，菌懸液的吸光度隨著時間的增加，變化不明顯，濕潤微膠囊和凍干微膠囊30～60 min內吸光度有個飛躍過程。分析可能是菌懸液從始至終一直未改變液體狀態，所以吸光度沒有明顯的變化，后期有輕微的上浮是因為菌體破裂，內容物釋放。凍干微膠囊前期的漲幅沒有濕潤微膠囊大，可能是因為它相較于濕膠囊來說有一個吸水膨脹崩解過程。由吸光度的變化情況可得，濕膠囊與人工模擬腸液接觸60 min，干膠囊接觸90 min后大部分菌體可被釋放。

圖8 菌懸液和微膠囊在人工模擬腸液中活菌數的變化

2.3.5 模擬消化道體系實驗結果

如圖9所示，在經過模擬消化道體系實驗后，菌懸液、濕潤微膠囊以及凍干微膠囊的活菌數都有較大的損失。但濕潤微膠囊和凍干微膠囊的最終活菌數均已達到國際標準。冷凍干燥過程會對菌體和微膠囊結構造成不可逆的損傷，實際生產中可考慮添加多種凍干保護劑，復配使用，以減弱低溫帶來的傷害。

圖9 菌懸液和微膠囊在人工模擬消化道體系中活菌數的變化

3 結論

本文采用內源乳化法制作雙歧桿菌微膠囊。通過單因素試驗和響應面法優化了其制備工藝，以包埋率為評價指標，得出雙歧桿菌微膠囊的最佳工藝配比為：海藻酸鈉質量分數2%，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)=2∶1，m(碳酸鈣)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，V(水相)∶V(油相)=2∶5，冰醋酸400 μL，雙歧桿菌微膠囊包埋率可達80.15%。進行驗證試驗，制作出雙歧桿菌濕潤微膠囊包埋率為80.11%，說明相關數據具有代表性，該實驗的最佳條件有較高的應用價值。

本文還對雙歧桿菌濕潤微膠囊和凍干微膠囊進行耐胃酸、膽鹽、腸道釋放性和消化道體系實驗，以雙歧桿菌菌懸液為對照組。結果表明，游離的雙歧桿菌在模擬人體消化液的作用下有較高的死亡率，而制作出的雙歧桿菌濕潤微膠囊和凍干微膠囊的理化性能指標均達標，體現了對不利環境的良好耐受性，為今后益生菌產品的開發和相關研究提供了理論基礎。