高通量氙光傳遞窗與紫外傳遞窗滅菌效果觀察

許 琦，趙 月，黃偉健，宋琳亮，康 生，劉 毅，和 君*，傅江南*

(1.暨南大學實驗動物管理中心，廣州 510632； 2.西安富康空氣凈化設備工程有限公司 西安 710000)

傳遞窗作為實驗動物屏障設施內物品傳遞的通道上的一種重要殺菌設備，主要用于潔凈區與非潔凈區、潔凈區與潔凈區之間物品的傳遞，以避免其受到環境的污染。常用的傳遞窗是利用紫外線(波長在225～275 nm，峰值253.7 nm)照射，產生能量傳遞和積累而達到破壞微生物核酸的目的[1]。紫外傳遞窗殺菌效果與紫外線的輸出能量、燈的類型、光的強度和使用時間有關。一旦紫外燈管老化，它將喪失30%～50%的光照強度，殺菌能力大打折扣[2]。為此，我國國家標準GB19258《紫外線殺菌燈》指出紫外燈殺菌最佳時間為30 min[3-4]。但在實際應用中，尤其是在人流、物流量大的科研中心或動物中心，使用30 min的照射時間，將很大程度上限制屏障環境的進出效率，影響工作效率。針對紫外燈傳遞窗滅菌效果受多種因素影響且耗時長的問題，本研究關注一種新型高通量氙光傳遞窗，它利用脈沖氙燈極化發光的原理，通過產生強烈的脈沖紫外光線，可快速對物品表面和空氣中的各類微生物進行滅活[5]。本研究針對細菌繁殖體(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌)[6-8]、細菌休眠體(枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢體)[9]、真菌(白色念珠菌)[10]這3種微生物形態的5種標準菌株經傳遞窗不同時間點的照射，通過與傳統紫外傳遞窗的殺菌效果進行對比分析，從而得到殺菌效果的評價。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

菌種：金黃色葡萄球菌(簡稱金葡，ATCC6538)、綠膿桿菌(簡稱綠膿，ATCC15442)、大腸桿菌(簡稱大腸，ATCC8099)、白色念珠菌(簡稱白念，ATCC10231)均購自廣東環凱微生物有限公司；枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢菌片(簡稱枯草ATCC9372)購自北京鑫四環消毒技術開發有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

腦心浸液培養基BHI(海博生物技術有限公司)；營養瓊脂胰蛋白胨大豆瓊脂TSA(海博生物技術有限公司)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA(環凱生物科技有限公司)；營養瓊脂NA(環凱生物科技有限公司)；TSB(海博生物技術有限公司)；胰蛋白胨生理鹽水溶液(TPS)由本實驗室制備。生物梅里埃公司DENSIMAT細菌濁度儀，MX-F渦旋儀，日本三洋MIR-262恒溫培養箱，傳統紫外傳遞窗(UVPB)，高90 cm×寬80 cm×長60 cm，配置20 W紫外線消毒燈6支，每支燈管平均輻照度為75.01 μW/cm2。FX-XB-D800高通量氙光傳遞窗(XePB)，高90 cm×寬82 cm×長88 cm(西安某公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

按照衛生部法監發[2002] 282 號[11]，復蘇菌種后，菌種培養至第四代(不同菌種的培養時間及溫度有所不同，詳見所購菌種的微生物檢測凍干質控菌種使用說明書)，挑取菌落接入5 mL TSB營養肉湯中，渦旋儀渦旋震蕩20 s，制成菌懸液備用，枯草芽孢桿菌本身即為黑色變種芽孢菌片，直接洗脫制成芽孢懸液。為便于活菌計數，細菌濁度儀讀取菌懸液濃度：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌菌懸液濃度取0.7～1.4 Mcf(麥氏濁度)；白色念珠菌菌懸液濃度取6.9 Mcf。

1.3.2 菌片的制備

滴片法，將滅菌后的10 mm×10 mm玻片平鋪于無菌平皿，逐片滴加10 μL菌液，自然風干后制成菌片。

1.3.3 傳遞窗殺菌檢測

將菌片平置于無菌平皿中，蓋上編號，平板放置數量參考醫藥工業潔凈室區沉降菌的測試方法中的相關規定[12]，傳遞窗內中線左右各三分之一處分別放入1皿，高通量氙光傳遞窗照射時間設定1 min、3 min、5 min；傳統紫外傳遞窗設定照射時間設定5 min、30 min進行檢測。

1.3.4 洗脫培養

照射后將菌片加入5 mL TPS中渦旋洗脫，取1 mL洗脫液于無菌培養皿，同時每皿倒入50℃，15 mL配置好的TSA培養基，白色念珠菌需倒入PDA培養基，凝固后，按各菌種適宜的培養條件分別進行培養。為防止菌落數過多不便于活菌計數，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌陽性菌片洗脫液需按照10-4與10-5比例稀釋后倒板；白色念珠菌陽性菌片洗脫液10-3與10-4稀釋后倒板；枯草芽孢桿菌陽性菌片洗脫液10-1與10-2稀釋后倒板。

1.3.5 活菌計數

陽性平板菌落數乘以稀釋倍數，即得到每毫升洗脫液中細菌數量(N0)。實驗組進行活菌計數，平皿長菌數為對應樣每毫升洗脫液中細菌數∶

殺菌率=(N0-NX)/N0×100%

式中：N0為每毫升洗脫液中細菌數量，NX為照射后每毫升菌片洗脫液中活菌個數。每組重復3次，取平均殺菌率。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 細菌繁殖體的抑菌率

紫外傳遞窗燈管為6根環繞式，其到菌片的直線距離分別為30 cm、52 cm和60 cm，均在表面消毒的有效范圍內[13]，因此本研究不單列不同的距離對殺菌效果的影響。此外，為對傳遞窗殺菌效率進行比較，高通量氙光傳遞窗的建議工作時長1 min、3 min、5 min，特選紫外傳遞窗的時長為5 min及最佳工作時長30 min進行比較。高通量氙光傳遞窗照射1～5 min對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及綠膿桿菌的平均殺菌率均可達99.99%以上。紫外傳遞窗照射5 min對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無明顯殺滅效果；照射30 min對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌方可達到高通量氙光傳遞窗照射1 min的殺菌率；照射30 min對大腸桿菌殺滅率達99.91%。

具體數據見表1、圖1、圖2。

2.2 照射對細菌休眠體的殺滅情況

高通量氙光傳遞窗照射1 min對枯草芽孢桿菌的殺菌率達99.96%，照射3 min、5 min可達100.00%。紫外傳遞窗照射5 min對枯草芽孢桿菌的殺滅率僅為45.20%，照射30 min殺菌率大于99.99%具體數據見表2、圖3。

2.3 照射對真菌的殺滅情況

高通量氙光傳遞窗照射1 min、3 min對白色念珠菌的平均殺菌率達99.97%，照射5 min殺菌率可達100.00%。紫外傳遞窗照射5 min對白色念珠菌無明顯殺滅效果，照射30 min殺菌率達100.00%。具體數據見表3、圖4。

表1 高通量氙光傳遞窗與紫外傳遞窗對3種細菌繁殖體的殺滅情況

注：獨立重復3次實驗，測試樣品n=6，陽性菌株n=4。

Note. Repeat 3 experiments independently. Testing samplen=6, Positive strainn=4.

注：A：金黃色葡萄球菌；B：大腸桿菌；C：綠膿桿菌；陽性對照：陽性洗脫液稀釋后鋪板，培養48 h。圖1 紫外傳遞窗和高通量氙光傳遞窗在不同照射時間點對金葡、大腸、綠膿的懸液涂布照射結果Note. A, Staphylococcus aureus. B, Escherichia coli. C, Pseudomonas aeruginosa. Positive control, The positive eluent was cultured 48 h after dilution.Figure 1 Result of radiation of High-throughput Xenon Ray Pass Box and ultraviolet Pass Box on Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa at different time points

注：A、B、C：高通量氙光傳遞窗(XePB)照射1 min、3 min、5 min,紫外傳遞窗(UVPB)照射30 min后金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌菌片洗脫液的含菌數。**P<0.01；****P<0.0001。圖2 紫外傳遞窗和高通量氙光傳遞窗在不同照射時間點對金葡、大腸、綠膿的差異分析Note. A,B,C, The number of bacteria in the eluent of staphylococcus aureus, escherichia coli and pseudomonas aeruginosa after 1, 3 and 5 min of high-throughput xenon light pass box irradiation and 30 min of uv light pass box irradiationFigure 2 Difference analysis of High-throughput Xenon Ray Pass Box and ultraviolet Pass Box on Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa at different time points

表2 高通量氙光傳遞窗與傳統紫外傳遞窗對枯草芽孢桿菌的殺滅情況

注：獨立重復3次實驗，測試樣品n=6，陽性菌株n=4。

Note. Repeat 3 experiments independently. Testing samplen=6, Positive strainn=4.

注：A：懸液涂布照射結果；陽性對照：陽性洗脫液稀釋后鋪板，培養72 h；B：差異分析。圖3 紫外傳遞窗和高通量氙光傳遞窗在不同照射時間點對枯草芽孢的殺滅情況Note. A, Result of radiation. Positive control, The positive eluent was cultured 72 h after dilution.B, Difference analysis.Figure 3 Result of radiation of High-throughput Xenon Ray Pass Box and ultraviolet Pass Box on Bacillus subtilis at different time points.

真菌Fungus高通量氙氣傳遞窗XePB紫外傳遞窗UVPB照射時間Exposure time 菌落數 Colony forming units殺菌率 Sterilizingrate照射時間Exposure time 菌落數 Colony forming units殺菌率 Sterilizing rate菌株濃度(CFU/mL)白色念珠菌Candida albicans1 min0.67±0.823 min0.67±0.525 min0 99.97%100% 5 min>300-30 min0100%3×103

注：獨立重復3次實驗，測試樣品n=6，陽性菌株n=4。

Note. Repeat 3 experiments independently. Testing samplen=6, Positive strainn=4.

3 討論

潔凈環境是確保無菌產品生產的重要影響因素[14]，傳遞窗作為屏障設施內的一種常用的輔助設備，能最大限度的降低潔凈區的污染[5]，對解決各種生物安全問題起到不可忽視的重要作用。紫外燈消毒殺菌是物體表面消毒的常用方法，此法經濟、實惠、方便。但其最佳消毒時間一般為30 min，如果大量實驗人員要進入潔凈區，往往需要等待較長時間，有時甚至個別實驗人員在未徹底殺菌后就將傳遞窗內的物品傳入潔凈區，增加了潔凈區病原微生物感染的風險，同時也對實驗人員和環境造成威脅。本文通過對紫外傳遞窗和高通量氙光傳遞窗對5種病原的不同照射時間對殺滅效果的影響進行實驗，探討不同類型傳遞窗的殺菌效果。

本文選取的5種菌株分別是金黃色葡萄球菌，它是細菌繁殖體中化膿菌的代表[6]；綠膿桿菌，是醫院感染中最常分離的細菌繁殖體的代表[7]；大腸桿菌，是細菌繁殖體中腸道菌的代表[8]；白色念珠菌，是空氣中真菌的代表[9]；枯草芽孢桿菌，是黑色變種芽孢為細菌休眠體的代表[10]，這5種菌是實驗動物中心的常見菌，也是《消毒產品消毒效果檢驗技術規范》里規定檢測滅菌效果的必備菌株，綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌更是CL級以上動物的常見污染菌[15]。紫外傳遞窗照射5 min對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌無明顯殺滅效果，對綠膿桿菌的殺滅率僅為45.20%，不同菌種間的差異大，對紫外光敏感度高的菌體短時間內被殺滅率較高[16]，照射30 min對5種菌殺菌率達99.91%以上。高通量氙光傳遞窗1 min能對5種菌造成 99.85% 以上的殺菌率，5 min殺菌率可達 100%，效果明顯好于傳統的紫外傳遞窗，且具有高效的特點。在人員流動性大、物品傳遞頻繁的動物中心，實驗動物的生存環境條件穩定與否將會直接決定著動物實驗數據的質量[17]，高通量氙光傳遞窗不僅為物品傳遞和人員進出節省了時間，降低了潔凈區的感染風險。此外，采用的氙氣為惰性氣體，不含汞，不污染環境。脈沖氙燈的壽命約為500 h[5]、激光光束質量好、穩定等優點(壽命期內其光譜能量分布幾乎不變[18-20])，需注意的是高通量氙光燈工作的頻閃階段應避免直視傳遞窗[18]。

高通量氙光傳遞窗利用高壓氙氣短時間內 (10～100 ms) 產生紫外線脈沖的原理，較傳統紫外傳遞窗汞原子激發釋放紫外光，通過各方面對比，其高效的殺菌能力，有望替代紫外傳遞窗，可更好的保障屏障環境、隔離污染，實現潔凈區的高效運作。