免疫力低下小鼠動物模型建立及快速檢測研究

田嘉軍，黃聘和，岳茜嵐，何其勵

(四川省疾病預防控制中心，成都 610041)

在市售提高免疫力功能的保健食品中，絕大部分產品提及適用人群是免疫力低下的人群，然而在《保健食品檢驗與評價技術規范》(以下簡稱《規范》)中，保健食品中的增強免疫力功能試驗只設了陰性對照組動物，建議必要時設陽性對照組。陰性對照組動物只需蒸餾水灌胃，不做其他處理，我們可以理解為正常免疫力功能的動物。這樣往往與檢測樣品的最終目的不同，因為有許多保健食品的保健功能是針對免疫力低下的人群。因此，免疫力低下小鼠動物模型的建立，將陽性對照加入到試驗設計中，陽性對照組動物就是免疫力低下動物組，相對于正常免疫力動物組，對完善增強免疫力功能檢驗試驗具有重大意義，這一動物模型的建立，對以后《規范》里增強免疫力功能檢驗試驗是否添加陽性對照積累原始實驗數據。

怎樣制造動物免疫力低下、怎樣快速驗證動物模型成立，這是本文的目的。但在《規范》根本沒有涉及這些方面的內容，免疫力低下動物摸型和評判指標也沒有標準可查。因此，本研究通過四種處理方法，對比尋找出快速有效建立免疫力低下的小鼠動物模型，并篩選部分檢測指標快速確定動物模型是否成立。提出簡單可靠的檢測指標，也是本研究的創新點之一。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供的KM小鼠，6～8周齡100只，全雌，體重18～22 g，SPF級，[SCXK(川)2018-19]；實驗動物房為屏障系統，[SYXK(川)2016-043]。溫度20℃～25℃，相對濕度40%～70%。本研究所有動物試驗，嚴格按照“實驗動物飼養管理和使用指南”進行，過程中按實驗動物使用的3R原則給與人道關懷，并經四川省疾病預防控制中心實驗動物倫理委員會批準(SCCDCDWLL2017007)。

1.2 主要試劑與儀器

環磷酰胺：江蘇盛迪醫藥有限公司生產，批號：16112625。氫化可的松：武漢福鑫化工有限公司生產，批號：170823。無水乙醇：成都金山化學試劑有限公司，批號：20170426。小鼠免疫球蛋白A、G、M ELISA檢測試劑盒:均由深圳子科生物科技有限公司生產，批號均為：201709。流式細胞儀(BD_FACSCalibur，貝克曼公司，美國)。全自動血液分析儀(SYSMEX XT-2000i型，奧林巴斯公司，日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

將100只全雌KM小鼠隨機分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組五個組，各組20只；每組又分成A、B兩部分，每部分為10只。

1.3.2 動物給藥途徑及劑量

Ⅰ組：環磷酰胺經口灌胃，劑量為100 mg/kg[1-3]，連續3 d；Ⅱ組：氫化可的松經口灌胃，劑量為80 mg/kg[4-6]，連續3 d；Ⅲ組：60%乙醇溶液經口灌胃，劑量為20 mL/kg，連續3 d；Ⅳ組：UVA紫外線皮膚照射(長波)，劑量為10 J/cm2，連續3 d，照射時間=(10 000 mJ/cm2)÷光強度；Ⅴ組：蒸餾水經口灌胃，劑量為20 mL/Kg，連續3 d。

1.3.3 小鼠實驗前后體重對比

實驗動物引進動物房觀察3 d后，小鼠無異常，稱量各試驗組小鼠體重，然后連續3 d給藥或處理，第4天取血前小鼠稱重[7-8]。

1.3.4 小鼠血清免疫球蛋白含量測定

在第4天結束實驗后，各組A部分動物取小鼠血至小玻璃試管中，水浴37℃，1 h，離心3000 r/min，5 min，取上層血清備用。用免疫球蛋白檢測試劑盒測定各組小鼠血清中IGG、IGA、IGM的含量。

1.3.5 小鼠外周血測定

第4天結束實驗后，各組B部分小鼠取血至含抗凝劑的小玻璃試管中，充分搖勻，制備抗凝血備用。用全自動血液分析儀測定小鼠外周血血常規指標。用BD_FACSCalibur流式細胞儀測定小鼠全血中B淋巴細胞CD19、T淋巴細胞CD3的含量，并觀察CD19/CD3的比值情況[9-12]。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠實驗前后體重稱量結果

實驗動物引進動物房觀察3 d后，進行完全隨機分組，稱量實驗前及實驗結束后體重。從表1可見，環磷酰胺組(Ⅰ組)、氫化可的松(Ⅱ組)和60%乙醇溶液組(Ⅲ組)體重均較對照組(Ⅴ組)有明顯差異。特別是60%乙醇溶液組(Ⅲ組)小鼠，體重還有下降的趨勢，體重均值比實驗前還低，3 d高濃度的乙醇連續灌胃，可能導致動物機體功能損傷。環磷酰胺組(Ⅰ組)和氫化可的松(Ⅱ組)由于藥物作用，實驗動物生長緩慢，動物機體功能有一定的影響。紫外線皮膚照射組(Ⅳ組)體重基本沒有受到影響，估計在此強度下的紫外線照射對實驗小鼠對機體損傷不大。

2.2 小鼠血清免疫球蛋白含量測定結果

按照小鼠免疫球蛋白檢測試劑盒的要求加入待檢血清樣10 μL,根據試劑盒提供的標準品測量得到的OD值繪制標準品工作曲線，將各組待測血清測得的OD值按曲線方程計算各樣本濃度值。從表2可見，環磷酰胺組(Ⅰ組)和60%乙醇溶液組(Ⅲ組)小鼠血清IGG、IGA、IGM的含量較對照組有明顯下降。氫化可的松(Ⅱ組)小鼠血清IGG和IGA含量亦有下降，提示機體免疫能力有下降。紫外線皮膚照射組(Ⅳ組)三者測量值與對照組(Ⅴ組)比較未見有統計學上的差異。

2.3 小鼠外周抗凝血血常規測定結果

選取白細胞數、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比、單核細胞百分比、中性粒細胞絕對值、淋巴細胞絕對值、單核細胞絕對值7個血常規指標作為觀察對象。環磷酰胺組(Ⅰ組)的白細胞數、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比、單核細胞百分比、淋巴細胞絕對值、單核細胞絕對值6個指標與對照組(Ⅴ組)比較有統計學上的差異；氫化可的松(Ⅱ組)的淋巴細胞百分比、淋巴細胞絕對值2個指標與對照組(Ⅴ組)比較有統計學上的差異；60%乙醇溶液組(Ⅲ組)的白細胞數、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比、淋巴細胞絕對值4個指標與對照組(Ⅴ組)比較有統計學上的差異；紫外線皮膚照射組(Ⅳ組)的淋巴細胞百分比、淋巴細胞絕對值2個指標與對照組(Ⅴ組)比較有統計學上的差異。其余各組各項指標與對照組(Ⅴ組)比較未見有統計學上的差異(見表3)。

表1 小鼠試驗前后體重

注：與Ⅴ組(空白對照組)比較,aP<0.01。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01.

表2 小鼠血清免疫球蛋白含量

注：與Ⅴ組(空白對照組)比較,aP<0.01,bP<0.05。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01,bP<0.05.

表3 小鼠實驗后血常規各項指標

注：與Ⅴ組(空白對照組)比較,aP<0.01,bP<0.05。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01,bP<0.05.

2.4 小鼠外周抗凝血B淋巴細胞CD19、T淋巴細胞CD3含量測定結果

環磷酰胺組(Ⅰ組)的B淋巴細胞CD19、T淋巴細胞CD3含量有明顯下降，遠遠小于對照組(見圖1)；氫化可的松(Ⅱ組)的B淋巴細胞CD19含量有減少，CD19/CD3比值與對照組(Ⅴ組)比較有統計學上的差異；60%乙醇溶液組(Ⅲ組)和紫外線皮膚照射組(Ⅳ組)與對照組(Ⅴ組)比較均未見有統計學上的差異(見表4)。

圖1 淋巴細胞計數圖Figure 1 Lymphocytes counting map

組別GroupB淋巴細胞CD19含量B-Lymphocyte CD19 contentT淋巴細胞CD3含量T-Lymphocyte CD3 contentCD19/CD3比值CD19/CD3 ratioⅠ組(Ⅰ Group)72±42.5a839±304.8a0.086±0.042aⅡ組(Ⅱ Group)1482±318.1b1874±364.40.824±0.260bⅢ組(Ⅲ Group)1553±1012.31790±503.10.809±0.376Ⅳ組(Ⅳ Group)2103±552.52203±626.31.019±0.338Ⅴ組(Ⅴ Group)2955±1039.12321±687.81.292±0.380

注：與Ⅴ組(空白對照組)比較,aP<0.01,bP<0.05。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01,bP<0.05.

3 討論

在免疫毒理學中常見的陽性物有地塞米松、氫化可的松、環磷酰胺等。這些陽性物能造成動物的免疫抑制。在眾多的相關文獻中，我們發現用環磷酰胺建立免疫力低下的動物模型，可以通過各種方式達到。鄧少嫦等[13]用劑量100 mg/kg的環磷酰胺3 d連續腹腔注射，郭靜等[14]用劑量為50 mg/kg的環磷酰胺4 d連續腹腔注射，張芮琪等[15]則用劑量為75 mg/kg的環磷酰胺隔天分3次腹腔注射，高敏等[16]還用偏最小二乘法(PLS)數學建模分析不同劑量環磷酰胺建立模型的情況，可以看出，以往的研究大多是以腹腔注射為給藥途徑，而為了與試驗組給藥途徑一致，本研究建立以灌胃為給藥途徑，連續3 d 100 mg/kg劑量的環磷酰胺，也可致KM小鼠免疫力低下模型成立。用本實驗條件下的環磷酰胺試驗組可引起KM小鼠體重明顯下降，小鼠血清免疫球蛋白含量(包括IGG、JGM、IGM)顯著下降，血常規指標白細胞數、淋巴細胞百分比、單核細胞百分比等指標都出現異常，小鼠外周血B淋巴細胞CD19、T淋巴細胞CD3含量顯著下降。由結果可得，環磷酰胺具有明顯的免疫抑制作用，選擇其作為保健食品增強免疫力功能評價實驗免疫力低下模型建立的陽性物是適宜的，動物模型在此條件下成立。

本實驗條件下的氫化可的松實驗組制造免疫力低下的動物模型某些指標沒有環磷酰胺實驗組理想，如血清免疫球蛋白IGM含量沒有顯著性差異、白細胞和單核細胞百分比沒有顯著性差異、外周血T淋巴細胞濃度亦沒有顯著性差異。氫化可的松可以建立小鼠免疫力低下的模型國內外很多研究已證明，大多為5次肌肉注射氫化可的松40 mg/(kg·BW)，本實驗條件為經口灌胃3 d 80 mg/(kg·BW)氫化可的松，可能在該實驗條件下，沒有肌注給藥途徑理想，但為了保持和實驗研究對象保持相同的給藥途徑，我們還是想優先考慮相同途徑，至于經口氫化可的松如何能達到理想的動物模型，有待我們進一步的研究。

本實驗條件下60%乙醇溶液組雖然能造成血清免疫球蛋白IGG、IGA、IGM含量顯著性下降，但造成動物體重顯著下降，對機體產生了嚴重的損害，不適宜作為免疫抑制的陽性物，至于用15%乙醇溶液灌胃30 d，這是含酒精產品做陰性對照組的灌胃條件，這樣是否會造成小鼠免疫力低下，需進一步研究。

本實驗條件下紫外線皮膚照射組沒有得出的滿意的結果，估計是紫外線照射劑量不合適，本實驗照射劑量是參考豚鼠皮膚光毒實驗劑量，在此劑量下豚鼠可以造成皮膚傷害，可能是豚鼠和小鼠存在種間差異的緣故。王麗英等提出紫外線對免疫系統的影響可能有雙重作用[17-22]，亦有可能誘發機體免疫抑制，又有可能誘導機體免疫保護，并對此種差異的產生列舉了4種不同因素有關，故紫外線對免疫系統的影響在學術界依然存在著很大的爭議。

因此，連續經口灌胃環磷酰胺(100 mg/kg)3 d，建立的KM小鼠免疫力低下的動物模型是成立的，是本實驗室首選條件。這一實驗條件的建立和實驗證明是建立免疫力低下小鼠動物模型的創新，在其他文獻資料中鮮見。

如何檢測免疫抑制動物模型成立，方法有很多，常見的有：臟器指數，血常規及生化指標，血清免疫球蛋白含量，NK活性細胞測定，碳廓清實驗，抗體生成細胞檢測，脾淋巴細胞轉化實驗等等，從各種檢測指標簡便容易程度上來看，體重、血清免疫球蛋白含量、血常規這三個指標簡單易得，檢測成本低廉且時間周期短，檢出有效率高。而外周血B淋巴細胞CD19、T淋巴細胞CD3含量的檢測費用高，檢測時間長，但測出的數值可靠性強[23-25]。本次研究這四種指標都相互驗證了實驗結果的可靠性，作為日常檢測工作的動物模型建立確認的指標，本研究推薦動物體重、血清免疫球蛋白含量、血常規三項易得的指標。推薦的這三項指標，亦是本研究大膽開創性的嘗試，期望在以后更多的實踐工作中同行能用實驗驗證與改進。