慢性阻塞性肺疾病動物模型的造模方法

劉 迪，張洪春

(1.北京中醫藥大學，北京 100029； 2.中日友好醫院肺病科 中日友好醫院呼吸中心 國家呼吸疾病臨床研究中心，北京 100029)

慢阻肺是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，病理學特征為小氣道重塑和肺氣腫，患者主要表現為氣流受限及持續性呼吸道癥狀(咳嗽、咳痰、氣喘等)，暴露于有毒顆粒及氣體中是與發病最相關的環境誘因[1]。慢阻肺發病機制主要與氣道和肺部炎癥、氧化-抗氧化失衡及蛋白酶-抗蛋白酶失衡相關[2]，其中炎癥在慢阻肺發展中起最重要作用，多機制共同作用造成小氣道狹窄、肺實質破壞，最終造成肺彈性回縮能力下降[3]。

2018年對中國十個省份57 779人的慢阻肺調查顯示：中國40歲以上人群慢阻肺患病率為13.7%，60歲以上人群患病率已超過27%。男性患者數為女性的2.2倍。全國總患病人數為9990萬，約占全球慢阻肺患者的25%，慢阻肺已經成為我國最常見的慢性疾病，對社會造成沉重負擔[4]。慢阻肺自2000年以來排在全球死亡原因第四位，全球疾病負擔(global burden of disease, GBD)研究預計到2020年慢阻肺將成為全球死因第三位[5]。盡管進行了廣泛的研究，但在分子水平上對慢阻肺的潛在機制仍知之甚少，因此目前尚無有效治療藥物，指南推薦穩定期患者吸入長效支氣管擴張劑以維持治療[1]。

動物模型對于進一步研究人類慢阻肺相關機制很有價值，建立穩定可靠并與臨床實際相符的動物模型是實驗成功的前提。基于此，本文結合文獻檢索和回顧性研究，對慢阻肺動物模型的動物種類及造模方法進行總結，這些信息對于選擇合適的動物，誘導方法和有關慢阻肺研究的主要測量參數有一定參考價值。

1 慢阻肺動物模型相關文獻檢索

1.1 檢索方法

以“animal model” “COPD” “emphysema” “chronic bronchitis”等為關鍵詞，檢索2016年9月1日至2019年9月1日PubMed數據庫收錄的文獻。納入進行慢阻肺動物造模，敘述造模具體方法，提供造模后模型評價參數并可獲取全文的英文文章。

1.2 檢索結果

最終納入符合要求的研究有164項，具體有170條造模方法(6項研究采用了兩種造模方法)。慢阻肺造模的模型動物主要為小鼠、大鼠、豚鼠，少部分用兔、猴、雪貂等。大部分研究采用單一方法造模，主要通過暴露于香煙煙霧(cigarette smoke, CS)，氣管內脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和鼻內彈性蛋白酶如豬胰彈性蛋白酶(porcine pancreatic elastase, PPE)滴注誘導造模；復合方法種類較多，多由單一造模方法聯合而成。造模評價主要測量參數為肺組織病理數據、肺部炎癥細胞和炎癥介質，少部分研究測量了肺功能、動脈血氣分析、肺部影像學等。

1.2.1 采用單一方法制作慢阻肺動物模型的研究

從造模方法來看，共有122項研究，126種動物模型采用單一方法造模，方法主要分為兩種：將動物暴露在誘導氣體中及鼻內、氣管內滴注或腹腔注射誘導劑。

共有90種動物模型通過將動物暴露在有毒有害氣體，如CS、臭氧、二氧化氮(nitrogen dioxide, NO2)、生物質燃料(biomass fuel, BMF)、機動車尾氣(motor vehicle exhaust, MVE)、大麻煙霧等中產生。其中79種動物模型采用CS暴露誘導，使用的動物包括：小鼠(57種)，大鼠(16種)，豚鼠(4種)，兔(1種)[6]，雪貂(1種)[7]；大部分采用在密閉容器內將動物全身長時間暴露于CS中造模，但暴露的劑量及頻次均不統一，暴露時間最長為40周，最短的為3 d；大部分研究進行了肺組織切片染色、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)收集及檢驗，少部分研究測量了動物肺功能；造模目的主要包括造模方法間比較，新的造模方法評價，發病機制、干預靶點研究，CS暴露對其他臟器影響，藥物治療，診斷等。6種動物模型由暴露于臭氧中誘導產生，選用的動物包括：小鼠(5種)，大鼠(1種)，大部分研究采用慢性暴露于臭氧中造模。2項研究采用慢性NO2干預大鼠制作慢阻肺動物模型。1項研究模型通過分別將大鼠慢性暴露于BMF和MVE中產生并探究其發病機制[8]。1項研究使用大麻煙霧造模并對模型進行了評價[9]。

26種動物模型采用氣管內或鼻內滴注PPE誘導而成，采用的動物包括：小鼠(24種)，大鼠(2種)；大部分采用單次滴注PPE，少部分研究采取多次滴注[10]。6種動物模型選用香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract, CSE)誘導而成，造模的動物包括：小鼠(5種)，大鼠(1種)；干預方式有多次腹腔注射、連續3周氣管內滴注、連續2周霧化吸入CSE溶液等。4種模型采用小鼠鼻內滴注LPS方法造模，其中Almeida等[11]采用第1、3天滴注兩次急性造模和每周兩次滴注，持續20周的方法慢性造模，以研究干細胞分別對LPS急慢性暴露后肺損傷的治療作用。

1.2.2 采用復合方法制作慢阻肺動物模型的研究

從造模方法來看，共有42項研究，44種動物模型采用復合方法造模，復合方法造模多是為了制作慢阻肺加重期動物模型，通過CS、LPS、PPE等誘導劑使模型動物產生肺氣腫樣病變，再聯合PM2.5急性暴露、接種細菌或病毒等使病情急性加重。

CS聯合LPS是最常使用的方法，共有22種動物模型通過此法制得，其中小鼠模型(3種)，大鼠模型(19種)，大部分采用慢性暴露于CS中聯合多次氣管內滴注LPS誘導產生。有8項研究采用CS或PPE暴露后在模型動物鼻內接種微生物以制作慢阻肺急性加重模型，其中Asakura等[12]在小鼠氣管內注射5U PPE，4周后鼻內接種肺炎球菌以造模；Zhao等[13]將大鼠慢性暴露于CS中聯合多次鼻內滴注肺炎克雷伯氏菌懸浮液造模；Sharan等[14]將小鼠暴露于CS中12周，然后使用非分型流感嗜血桿菌(non-typeable Haemophilus influenzae, NTHi)攻擊小鼠，并通過測量肺功能、肺組織、BALF對加重模型進行評價；Bucher等[15]將小鼠暴露于CS中9 d后鼻內接種H1N1流感病毒；Jang等[16]將食蟹猴暴露于CS中4周后鼻內滴注H3N2病毒造模；Harada等[17]采用在小鼠氣管內單次滴注PPE，12 d后鼻內接種H1N1型流感病毒，并在4 d后鼻內接種肺炎鏈球菌以模擬慢阻肺患者繼發性細菌性肺炎。

5項研究采用PPE聯合LPS造模，既有多次PPE及LPS暴露制作慢阻肺模型[18]，又有多次氣管內滴注PPE造模后，通過單次氣管內滴注LPS以制作慢阻肺急性加重模型[19]。有3項研究采用將小鼠慢性暴露于CS中聯合多次腹腔注射CSE造模。有2項研究通過將小鼠或大鼠暴露于CS中并多次在氣管內滴注PM2.5混懸液以研究急性PM2.5暴露造成的肺損傷。Rodrigues等[20]的研究采用將小鼠全身暴露于CS中60 d聯合前30 d鼻內滴注PPE誘導慢阻肺模型并對模型進行肺功能及肺組織病理學評價。1項研究采用多次氣管內滴注LPS及CSE制作慢阻肺動物模型[21]。1項研究采用氣管內單次滴注LPS后將小鼠慢性暴露于MVE中造模，并通過肺功能、肺組織、BALF對此種模型進行評估[22]。

以上為PubMed數據庫收錄的2016年9月至2019年9月有關慢阻肺造模研究涉及的慢阻肺造模動物及造模方法的簡單介紹，需要注意的是以上僅為慢阻肺造模相關文獻的部分，并不能完全概括慢阻肺所有的造模方法。

2 慢阻肺實驗動物的選擇

構建慢阻肺動物模型的動物種類有嚙齒類動物(小鼠，大鼠，豚鼠等)、哺乳動物(兔、犬、豬、猴等)，最常用的是小鼠和大鼠。

2.1 嚙齒類動物

嚙齒類動物作為最常用的種類有如下優勢：①繁殖周期短、數量多，造模成本低；②體型小，便于進行實驗；③檢驗檢查設備、試劑等較全面；④基因組序列研究深入。但也存在以下不足：①肺部解剖與人類有差異，如沒有明確的呼吸性細支氣管，無法形成小葉中央型肺氣腫[23]，支氣管中無杯狀細胞；②診斷方式與人類不同，人類慢阻肺診斷以肺功能為金標準，但嚙齒類動物進行肺功能評價困難，大多通過肺病理組織學判斷炎癥細胞浸潤及肺氣腫程度；③體型小，血液及肺組織連續取材受限；④不同品系造模損害程度有差異，Harada等[24]研究表明BALB/cJ小鼠較C57BL/6J小鼠對外源性蛋白酶刺激更敏感，具體表現為肺功能下降更顯著，肺組織炎癥細胞更多，死亡率更高等。

嚙齒類動物中小鼠最為常用。大鼠相對而言更不容易因CS暴露造成肺氣腫樣損傷[25]。豚鼠解剖學、生理及煙霧暴露后病理反應，包括炎癥、肺氣腫、小氣道重塑及肺功能改變與人類相似[26]，而且豚鼠造模后粘液高分泌和肺氣腫表現更突出，更適合進行肺部疾病研究[27]，但豚鼠具有使用成本高，體溫調節能力差，缺乏人類免疫抗體等工具，難以進行分子研究[28]等不足，這限制了豚鼠在實際研究中的應用。

2.2 其他動物

兔、犬、豬、猴等哺乳動物也可用于慢阻肺造模，雖然肺部組織病理等與人類更相似，但因其成本高，不便操作等，使用率較嚙齒類動物少。如：Raju等[7]研究示：將雪貂僅鼻暴露于CS中6個月后，雪貂出現清晨自發性咳嗽及氣道阻塞、慢性粘液高分泌及以氣道為中心明顯的細菌感染的病理特征，與大鼠、小鼠相比更加符合人類慢阻肺特征，但小氣道阻力(即組織阻尼)并未見明顯升高，這與人類慢阻肺病理特征并不相符，因此還需要進一步的研究。

關于性別對慢阻肺發病的影響方面，現有研究有相互矛盾之處。Tam等[29]研究顯示暴露于6個月CS后，相較于雄性或卵巢切除小鼠，雌性小鼠的小氣道壁重塑增加，并與遠端氣道阻力增加，抗氧化劑基因下調，氧化應激增加和TGF-β1活化有關，這些病變可以通過卵巢切除術來預防，實驗表明長期暴露于CS中的雌性小鼠小氣道病變與氧化應激、TGF-β1信號轉導增加及雌性激素作用相關，雌激素受體拮抗作用可能在減少女性吸煙者的氧化應激中具有價值。而Shen等[30]研究顯示與雌性SH和雄性WKY大鼠相比，雄性SH大鼠表現出更明顯的細胞、炎癥和結構變化，更易出現慢阻肺樣病變，其研究認為雄性SH大鼠是研究慢阻肺的最佳嚙齒動物模型。

3 慢阻肺動物模型的制備及評價

目前構建慢阻肺動物模型主要通過CS暴露，氣管內或鼻內滴注LPS、PPE、基因修飾等單一或復合因素造模。模型評價主要測量參數為肺組織病理數據、肺部炎癥細胞和炎癥介質，少部分研究測量了肺功能、動脈血氣分析、肺部影像學等。

3.1 有害氣體暴露

除遺傳因素外，吸煙、空氣污染、職業性粉塵和化學物質、生物燃料煙霧等構成了慢阻肺發病最主要的環境因素[31]。常用來造模的有害氣體包括：CS，NO2，臭氧，PM2.5，MVE等。

3.1.1 CS暴露

CS是公認的慢阻肺發病最相關的危險因素之一，CS暴露造模最接近人類患病的環境，因此CS是用來制作慢阻肺動物模型的最常用有害氣體，CS中含有超過4500種化學品，包括多種高度活性的自由基，可誘發炎癥和致癌反應[32]，暴露于CS引起或加重與氧化應激和炎癥相關的多種肺部疾病，包括慢阻肺和肺癌[33]，但其致病分子機制仍知之甚少。暴露于CS導致小氣道阻塞，這與支氣管纖維化、炎癥浸潤和上皮-間質轉化有關，進而導致氣道重塑[34]，引起肺功能下降。氣道重塑的特征在于氣道壁結構的變化，包括平滑肌肥大、基底膜增厚、黏膜下纖維化、黏液細胞化生、上皮脫落和血管生成[35]。

CS暴露分為兩種：全身暴露于充滿CS的密閉容器內或通過管道使動物僅鼻吸入CS，目前CS暴露的劑量、時間等并沒有統一標準，一般認為至少需要暴露在CS中3個月。Xia等[36]把小鼠暴露在總懸浮顆粒物(total particulate matter, TPM) 為500 mg/m3的CS中4周后，發現與對照組小鼠相比，CS暴露小鼠BALF中總細胞、單核細胞和中性粒細胞的數量增加，肺組織中白細胞介素 (interleukin, IL)-6和IL-8的mRNA水平和BALF上清液中IL-6和IL-8的分泌水平升高，肺組織病理示有小氣道增厚和膠原沉積，使用整體體積描記法測量的氣道高反應性(airway hyperresponsiveness，AHR)較對照組小鼠增高，表明暴露于CS 4周即會引起肺部炎癥和支氣管上皮細胞損傷，進而影響氣道重塑，導致肺功能障礙。

Drummond等[37]的研究表明：母體產前(交配前2周直至分娩)和小鼠成年前(出生后21～49 d)的CS暴露對成年早期的肺功能下降具有協同作用，這與產前肺發育受損是導致成年期慢阻肺的肺功能加速下降的危險因素假說相一致，但協同作用似乎不是由產前或青春期CS暴露對早期肺衰老的影響所介導的，生命早期階段與氣道上皮細胞分化和肺泡形成有關的分子機制還需要進行進一步研究。Polverino等[38]研究顯示：CS暴露24周小鼠的肺和腎內皮細胞(endothelial cell, EC)損傷與肺和腎中組織氧化應激-高級糖化終末產物(advanced glycation end products, AGEs) -高級糖化終末產物受體(receptor for AGEs, RAGE) -內皮損傷途徑的增加有關。還有研究表明CS 暴露對骨[39]和骨骼肌[40]也會產生一定負面影響。

3.1.2 臭氧

CS誘導的模型產生持續的氣流限制，肺實質破壞，但CS模型耗時較久。除了吸煙，空氣污染和職業暴露也是慢阻肺發病常見的原因，臭氧作為主要污染物之一，可直接與呼吸道發生反應，損傷肺組織，因此也有部分研究選用臭氧造模。Sun等[41]將小鼠全身暴露在濃度為2.5 ppm臭氧中，每次3 h，每周2次，持續7周，可以觀察到小鼠出現類似于慢阻肺患者的用力呼氣量減少，肺泡擴大，肺實質破壞，易疲勞，活動距離減少，炎癥增加。

3.1.3 NO2

3.2 PPE

CS暴露雖然被認為是最符合人類慢阻肺發展的模型，但其存在造模時間長，肺泡擴大程度較輕[44]，停止煙霧暴露后病情停止進展，這與人類停止吸煙后慢阻肺情況依舊進展[45]不相吻合，因此蛋白酶作為一種替代方法，在發現人類α1-抗胰蛋白酶缺乏癥和慢阻肺之間的關聯后應運而生[46]，目前認為肺中蛋白酶和抗蛋白酶之間的失衡與慢阻肺形成有關。在模型動物氣管內或鼻內灌注彈性蛋白酶，如木瓜蛋白酶、人中性粒細胞彈性蛋白酶和PPE，可誘導肺氣腫形成[46-47]，其中PPE較為常用。雖然這與人類慢阻肺病因不同，但可以導致模型動物產生持續性肺氣腫，且肺氣腫的程度在單個蛋白酶滴注后逐漸惡化，提示蛋白酶誘導的急性損傷觸發的宿主內源性反應有助于漸進性肺氣腫形成[48]。

Lan等[49]研究顯示，小鼠氣管內滴注PPE(用量為1.5 mg/kg，溶解在50 μL無菌磷酸緩沖鹽溶液中)后，相較于對照組小鼠，實驗組小鼠出現類似于人類的肺組織平均線性截距長度顯著增加，肺部炎癥浸潤及膠原沉積。Dharwal等[50]研究顯示，氣管內滴注 1 U PPE后7 d，小鼠炎癥反應最強烈，21 d肺氣腫病變最顯著。Shibata等[48]研究顯示：鼻內滴注0.6 U PPE后，小鼠肺浸潤性嗜堿性粒細胞分泌的IL-4促進肺浸潤性單核細胞分化為產生致病性基質金屬蛋白酶(metalloproteinase，MMP)-12的間質巨噬細胞，導致肺氣腫形成，這僅可在肺氣腫早期病變中發現，從而證明了之前未被重視的嗜堿性粒細胞、IL-4和間質巨噬細胞在肺氣腫的發展中的作用。

3.3 LPS

LPS是革蘭陰性菌細胞壁外膜中的重要成分，進入機體后可以刺激單核細胞、中性粒細胞等產生腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor, TNF)、IL -1、IL-6、集落刺激因子、干擾素等多種炎癥介質，使機體產生炎癥反應，進而形成肺氣腫[51]。Khedoe等[52]研究顯示：通過第1、3天鼻內分別滴注10 μg大腸桿菌LPS誘導急性肺損傷，可導致小鼠BALF中性粒細胞浸潤和全身IL-6水平升高，在每周兩次鼻內滴注10 μg LPS，持續20周的慢性研究中，可誘導小鼠產生持續氣道炎癥和肺氣腫，但相較于PPE誘導的肺氣腫，LPS誘導的模型動物中肺泡組織損傷程度較輕。LPS誘導的肺氣腫只是短時間內造成肺損傷，形成肺氣腫樣病變，但不會出現漸進性通氣障礙，因此只能復制慢阻肺的部分特征[53]。

3.4 復合造模方法

慢阻肺常用的復合造模方法包括CS暴露聯合LPS、PPE、CSE或PM2.5，LPS聯合PPE、CSE或MVE等，及單一方法聯合細菌或病毒接種誘發慢阻肺急性加重模型，內容可參照1.2.2部分。

4 小結

慢阻肺動物模型常選用大鼠和小鼠作為模型動物，少數研究使用豚鼠、犬、豬、猴等動物造模。常用造模誘導劑包括有害氣體(如CS、LPS、PPE等)，這些誘導劑都可以使模型動物產生肺部炎癥及肺氣腫改變，但干預時間及具體表現有所差異。CS誘導與人類慢阻肺發病病因相似，暴露后造成實驗動物肺部炎癥(BALF中炎癥細胞數增加，炎癥因子分泌增多，肺組織中炎癥因子水平升高)，氣道重塑(小氣道增厚和膠原沉積)，肺功能障礙(氣道高反應性)等病變[36]，但CS存在暴露周期長，肺泡病變輕，停止暴露后病情進展中止等不足。PPE單次滴注即可引起模型動物產生肺部炎癥及肺氣腫改變，且肺氣腫病變呈漸進性、持續性。LPS反復滴注亦可引起模型動物產生持續性氣道炎癥及肺氣腫，肺泡損傷輕于PPE誘導模型動物，但PPE及LPS干預都存在與人類發病病因不同的不足。大部分研究采用單一誘導劑引起模型動物慢阻肺病變，近年來越來越多的研究使用多種因素聯合造模，因為復合因素造模比單一方法造模更符合人類慢阻肺病理表現且常常可以縮短造模時間。

建立人體疾病動物模型，通過其與人類疾病的對比研究，可以深入探索疾病發病機制，尋找治療靶點及作用通路，開發治療藥物等，對疾病研究意義重大。但動物與人類生理病理差異，誘導方法作用機制未明，動物模型評價尚未統一標準，這些因素都對慢阻肺動物模型的研究造成一定影響。良好的動物模型應該具有與人類相似的解剖、生理、病理特征，造模方法具有一定的規范，以便于重復再現，并且研究者可根據實驗目的不同選擇相應的模型動物及造模方法。因此未來對于慢阻肺的實驗研究應著重于選擇最適合的動物種類及品系，對造模方法及模型評價形成一定的標準，以便制作出最符合人類生理病理機制的動物模型。